Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą.Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Tuo tarpu norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę pateiksime be stilių ir „JavaScript“.
Genų vektoriai, skirti plaučių cistinei fibrozei gydyti, turi būti nukreipti į laidžius kvėpavimo takus, nes periferinė plaučių transdukcija neturi terapinio poveikio.Viruso transdukcijos efektyvumas yra tiesiogiai susijęs su nešiotojo buvimo laiku.Tačiau tiekimo skysčiai, tokie kaip genų nešikliai, įkvėpimo metu natūraliai difunduoja į alveoles, o bet kokios formos gydomosios dalelės greitai pašalinamos per mukociliarinį transportą.Genų nešiotojų buvimo kvėpavimo takuose trukmės pailginimas yra svarbus, bet sunkiai pasiekiamas.Su nešikliu konjuguotos magnetinės dalelės, kurios gali būti nukreiptos į kvėpavimo takų paviršių, gali pagerinti regioninį taikymą.Dėl problemų, susijusių su vaizdavimu in vivo, tokių mažų magnetinių dalelių elgesys ant kvėpavimo takų paviršiaus, kai naudojamas magnetinis laukas, yra menkai suprantamas.Šio tyrimo tikslas buvo naudoti sinchrotroninį vaizdą, kad būtų galima vizualizuoti magnetinių dalelių serijos judėjimą anestezuotų žiurkių trachėjoje in vivo, siekiant ištirti pavienių ir masinių dalelių dinamiką ir elgesio modelius in vivo.Tada taip pat įvertinome, ar lentivirusinių magnetinių dalelių pristatymas esant magnetiniam laukui padidintų transdukcijos efektyvumą žiurkės trachėjoje.Sinchrotroninis rentgeno vaizdas parodo magnetinių dalelių elgseną stacionariuose ir judančiame magnetiniuose laukuose in vitro ir in vivo.Dalelės negali būti lengvai nutemptos gyvų kvėpavimo takų paviršiumi naudojant magnetus, tačiau transportavimo metu nuosėdos koncentruojasi regėjimo lauke, kur magnetinis laukas stipriausias.Transdukcijos efektyvumas taip pat padidėjo šešis kartus, kai lentivirusinės magnetinės dalelės buvo tiekiamos esant magnetiniam laukui.Visi šie rezultatai rodo, kad lentivirusinės magnetinės dalelės ir magnetiniai laukai gali būti vertingi būdai pagerinti genų vektorių nukreipimą ir transdukcijos lygius laidžiuose kvėpavimo takuose in vivo.
Cistinę fibrozę (CF) sukelia vieno geno, vadinamo CF transmembraninio laidumo reguliatoriumi (CFTR), kitimai.CFTR baltymas yra jonų kanalas, esantis daugelyje epitelio ląstelių visame kūne, įskaitant kvėpavimo takus, kurie yra pagrindinė cistinės fibrozės patogenezės vieta.CFTR defektai sukelia nenormalų vandens transportavimą, kvėpavimo takų paviršiaus dehidrataciją ir sumažėjusį kvėpavimo takų paviršiaus skysčio sluoksnio (ASL) gylį.Tai taip pat pablogina mukociliarinio transportavimo (MCT) sistemos gebėjimą išvalyti kvėpavimo takus nuo įkvepiamų dalelių ir patogenų.Mūsų tikslas yra sukurti lentivirusinę (LV) genų terapiją, kad būtų galima pateikti teisingą CFTR geno kopiją ir pagerinti ASL, MCT bei plaučių sveikatą, ir toliau kurti naujas technologijas, kurios gali išmatuoti šiuos parametrus in vivo1.
LV vektoriai yra vienas iš pirmaujančių cistinės fibrozės genų terapijos kandidatų, daugiausia todėl, kad jie gali visam laikui integruoti terapinį geną į kvėpavimo takų bazines ląsteles (kvėpavimo takų kamienines ląsteles).Tai svarbu, nes jie gali atkurti normalią hidrataciją ir gleivių klirensą, diferencijuodami į funkcines genų pakoreguotas kvėpavimo takų paviršiaus ląsteles, susijusias su cistine fibroze, o tai duoda naudos visam gyvenimui.KS vektoriai turi būti nukreipti prieš laidžius kvėpavimo takus, nes čia prasideda plaučių įsitraukimas į CF.Vektorius patekęs giliau į plaučius, gali sukelti alveolių transdukciją, tačiau tai neturi terapinio poveikio cistinei fibrozei.Tačiau skysčiai, tokie kaip genų nešiotojai, natūraliai migruoja į alveoles įkvėpus po gimdymo3, 4, o gydomosios dalelės MCT greitai pašalinamos į burnos ertmę.LV transdukcijos efektyvumas yra tiesiogiai susijęs su trukme, kurią vektorius išlieka arti tikslinių ląstelių, kad galėtų įsisavinti ląsteles – „gyvenimo laikas“ 5, kurį lengvai sutrumpina tipiškas regioninis oro srautas, taip pat koordinuotas gleivių ir MCT dalelių įsisavinimas.Cistinės fibrozės atveju gebėjimas pailginti LV buvimo kvėpavimo takuose laiką yra svarbus norint pasiekti aukštą transdukcijos lygį šioje srityje, tačiau iki šiol tai buvo sudėtinga.
Norėdami įveikti šią kliūtį, siūlome, kad LV magnetinės dalelės (MP) galėtų padėti dviem vienas kitą papildančiais būdais.Pirma, juos galima nukreipti magnetu į kvėpavimo takų paviršių, kad būtų pagerintas nukreipimas ir padėtų genų nešiklio dalelėms būti tinkamoje kvėpavimo takų srityje;ir ASL) pereina į ląstelės sluoksnį 6. MP yra plačiai naudojami kaip tikslinės vaistų tiekimo priemonės, kai jie jungiasi prie antikūnų, chemoterapinių vaistų ar kitų mažų molekulių, kurios prisitvirtina prie ląstelių membranų arba jungiasi prie atitinkamų ląstelių paviršiaus receptorių ir kaupiasi naviko vietose statinės elektros buvimas.Magnetiniai laukai vėžio gydymui 7. Kiti „hiperterminiai“ metodai yra skirti navikinių ląstelių naikinimui kaitinant MP, kai jas veikia svyruojantys magnetiniai laukai.Magnetinės transfekcijos principas, kai magnetinis laukas naudojamas kaip transfekcijos agentas, skatinantis DNR perkėlimą į ląsteles, dažniausiai naudojamas in vitro, naudojant įvairius nevirusinius ir virusinius genų vektorius, skirtus sunkiai perkeliamoms ląstelių linijoms. ..Nustatytas KS magnetotransfekcijos efektyvumas, kai KS MP tiekiamas in vitro į žmogaus bronchų epitelio ląstelių liniją, esant statiniam magnetiniam laukui, padidinant transdukcijos efektyvumą 186 kartus, lyginant su vien KS vektoriumi.LV MT taip pat buvo pritaikytas cistinės fibrozės modeliui in vitro, kai magnetinė transfekcija padidino LV transdukciją oro ir skysčio sąsajos kultūrose 20 kartų, kai yra cistinės fibrozės skreplių10.Tačiau in vivo organų magnetotransfekcijai buvo skiriama palyginti mažai dėmesio ir ji buvo įvertinta tik keliuose tyrimuose su gyvūnais 11, 12, 13, 14, 15, ypač plaučiuose16, 17.Tačiau magnetinės transfekcijos galimybės plaučių terapijoje sergant cistine fibroze yra aiškios.Tan ir kt.(2020) teigė, kad „veiksmingo magnetinių nanodalelių patekimo į plaučius patvirtinimo tyrimas atvers kelią būsimoms CFTR įkvėpimo strategijoms, siekiant pagerinti klinikinius rezultatus pacientams, sergantiems cistine fibroze“6.
Smulkių magnetinių dalelių elgseną kvėpavimo takų paviršiuje, veikiant magnetiniam laukui, sunku vizualizuoti ir ištirti, todėl jos menkai suprantamos.Kituose tyrimuose sukūrėme sinchrotroniniu sklidimu pagrįstą fazinio kontrastinio rentgeno vaizdavimo (PB-PCXI) metodą, skirtą neinvaziniam vaizdavimui ir nedidelių ASL18 gylio bei MCT19 elgsenos in vivo pokyčių kiekybiniam įvertinimui20, kad būtų galima tiesiogiai matuoti dujų kanalo paviršiaus hidrataciją. ir naudojamas kaip ankstyvas gydymo veiksmingumo rodiklis.Be to, mūsų MCT vertinimo metodas naudoja 10–35 µm skersmens daleles, sudarytas iš aliuminio oksido arba didelio lūžio rodiklio stiklo, kaip MCT žymenis, matomus naudojant PB-PCXI21.Abu metodai tinka įvairių tipų dalelių, įskaitant MP, vaizdavimui.
Dėl didelės erdvinės ir laiko skiriamosios gebos mūsų PB-PCXI pagrįsti ASL ir MCT tyrimai puikiai tinka tirti atskirų ir masinių dalelių dinamiką ir elgesio modelius in vivo, kad padėtų mums suprasti ir optimizuoti MP genų pristatymo metodus.Čia naudojamas metodas yra pagrįstas mūsų tyrimais, naudojant SPring-8 BL20B2 spindulio liniją, kurioje vizualizavome skysčių judėjimą po to, kai į pelių nosies ir plaučių kvėpavimo takus buvo įvesta manekeno vektoriaus dozė, kad padėtų paaiškinti mūsų pastebėtus nevienalyčius genų ekspresijos modelius. mūsų gene.tyrimai su gyvūnais su nešiklio doze 3,4 .
Šio tyrimo tikslas buvo panaudoti PB-PCXI sinchrotroną, kad būtų galima vizualizuoti MP serijos judesius gyvų žiurkių trachėjoje in vivo.Šie PB-PCXI vaizdo gavimo tyrimai buvo skirti MP serijoms, magnetinio lauko stiprumui ir vietai išbandyti, siekiant nustatyti jų poveikį MP judėjimui.Darėme prielaidą, kad išorinis magnetinis laukas padėtų pristatytam MF likti arba persikelti į tikslinę sritį.Šie tyrimai taip pat leido mums nustatyti magnetų konfigūracijas, kurios maksimaliai padidina dalelių, likusių trachėjoje po nusodinimo, kiekį.Antroje tyrimų serijoje siekėme naudoti šią optimalią konfigūraciją, kad parodytume transdukcijos modelį, atsirandantį dėl KS-MP tiekimo in vivo į žiurkės kvėpavimo takus, darant prielaidą, kad KS-MP tiekimas taikant kvėpavimo takus lems. padidėjus KS transdukcijos efektyvumui..
Visi tyrimai su gyvūnais buvo atlikti pagal Adelaidės universiteto (M-2019-060 ir M-2020-022) ir SPring-8 sinchrotrono gyvūnų etikos komiteto patvirtintus protokolus.Eksperimentai buvo atlikti pagal ARRIVE rekomendacijas.
Visi rentgeno vaizdai buvo paimti naudojant BL20XU spindulio liniją SPring-8 sinchrotrone Japonijoje, naudojant sąranką, panašią į aprašytą anksčiau 21, 22.Trumpai tariant, eksperimentinė dėžė buvo 245 m atstumu nuo sinchrotrono saugojimo žiedo.0,6 m atstumas nuo mėginio iki detektoriaus naudojamas dalelių vaizdavimo tyrimams ir 0,3 m atstumas in vivo vaizdo tyrimams, kad būtų sukurti fazės kontrasto efektai.Naudotas monochromatinis pluoštas, kurio energija 25 keV.Vaizdai buvo gauti naudojant didelės skiriamosios gebos rentgeno keitiklį (SPring-8 BM3), sujungtą su sCMOS detektoriumi.Keitiklis paverčia rentgeno spindulius matoma šviesa naudodamas 10 µm storio scintiliatorių (Gd3Al2Ga3O12), kuris tada nukreipiamas į sCMOS jutiklį naudojant ×10 (NA 0,3) mikroskopo objektyvą.sCMOS detektorius buvo „Orca-Flash4.0“ („Hamamatsu Photonics“, Japonija), kurio matricos dydis buvo 2048 × 2048 pikselių, o neapdorotas pikselių dydis – 6,5 × 6,5 µm.Šis nustatymas suteikia efektyvų 0,51 µm izotropinį pikselių dydį ir apytiksliai 1,1 mm × 1,1 mm matymo lauką.100 ms ekspozicijos trukmė buvo pasirinkta siekiant maksimaliai padidinti magnetinių dalelių signalo ir triukšmo santykį kvėpavimo takų viduje ir išorėje, kartu sumažinant judesio artefaktus, kuriuos sukelia kvėpavimas.Atliekant tyrimus in vivo, rentgeno spindulių kelyje buvo įdėtas greitas rentgeno užraktas, siekiant apriboti radiacijos dozę blokuojant rentgeno spindulį tarp ekspozicijų.
LV terpė nebuvo naudojama jokiuose SPring-8 PB-PCXI vaizdo gavimo tyrimuose, nes BL20XU vaizdo kamera nėra sertifikuota 2 biologinės saugos lygiu.Vietoj to, iš dviejų komercinių pardavėjų pasirinkome įvairius gerai apibūdintus MP, apimančius įvairius dydžius, medžiagas, geležies koncentraciją ir pritaikymą , – pirmiausia norėdami suprasti, kaip magnetiniai laukai veikia MP judėjimą stiklo kapiliaruose, o paskui gyvi kvėpavimo takai.paviršius.MP dydis svyruoja nuo 0,25 iki 18 µm ir yra pagamintas iš įvairių medžiagų (žr. 1 lentelę), tačiau kiekvieno mėginio sudėtis, įskaitant MP magnetinių dalelių dydį, nežinoma.Remdamiesi mūsų išsamiais MCT tyrimais 19, 20, 21, 23, 24, tikimės, kad iki 5 µm MP gali būti matomas trachėjos kvėpavimo takų paviršiuje, pavyzdžiui, atimant nuoseklius kadrus, kad būtų geriau matomas MP judėjimas.Vienas 0,25 µm MP yra mažesnis nei vaizdo gavimo įrenginio skiriamoji geba, tačiau tikimasi, kad PB-PCXI aptiks jų tūrinį kontrastą ir paviršiaus skysčio, ant kurio jie nusodinami, judėjimą.
Kiekvieno MP pavyzdžiai lentelėje.1 buvo paruoštas 20 μl stikliniuose kapiliaruose (Drummond Microcaps, PA, JAV), kurių vidinis skersmuo 0,63 mm.Korpuskulinės dalelės yra vandenyje, o CombiMag dalelės yra gamintojo patentuotame skystyje.Kiekvienas mėgintuvėlis iki pusės pripildytas skysčio (maždaug 11 µl) ir uždedamas ant mėginio laikiklio (žr. 1 pav.).Stikliniai kapiliarai buvo atitinkamai išdėstyti horizontaliai ant scenos vaizdo kameroje ir išdėstyti skysčio kraštuose.19 mm skersmens (28 mm ilgio) nikelio apvalkalo magnetas, pagamintas iš retųjų žemių, neodimio, geležies ir boro (NdFeB) (N35, kat. Nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australija), kurio liekana 1,17 T, buvo pritvirtintas prie atskira perdavimo lentelė pasiekti Nuotoliniu būdu pakeiskite savo padėtį atvaizdavimo metu.Rentgeno spindulių vaizdavimas prasideda, kai magnetas yra maždaug 30 mm virš mėginio, o vaizdai gaunami 4 kadrų per sekundę greičiu.Vaizdo kūrimo metu magnetas buvo priartintas prie stiklo kapiliarinio vamzdelio (maždaug 1 mm atstumu), o po to perkeliamas išilgai vamzdžio, kad būtų įvertintas lauko stiprumo ir padėties poveikis.
In vitro vaizdavimo sąranka, kurioje yra MP mėginiai stiklo kapiliaruose xy mėginio transliacijos etape.Rentgeno spindulio kelias pažymėtas raudona punktyrine linija.
Nustačius MP matomumą in vitro, jų pogrupis buvo išbandytas in vivo su laukinių Wistar albinosų žiurkių patelėmis (~ 12 savaičių amžiaus, ~ 200 g).Medetomidinas 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japonija), midazolamas 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonija) ir butorfanolis 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Žiurkės buvo anestezuotos Pharma (Japonija) mišiniu intraperitonine injekcija.Po anestezijos jie buvo paruošti vaizdavimui pašalinant kailiuką aplink trachėją, įkišant endotrachėjinį vamzdelį (ET; 16 Ga intraveninė kaniulė, Terumo BCT) ir imobilizuojami gulimoje padėtyje ant pagal užsakymą pagamintos vaizdinės plokštelės su terminiu maišeliu. kūno temperatūrai palaikyti.22. Tada vaizdo plokštė buvo pritvirtinta prie mėginio stadijos vaizdo gavimo dėžutėje nedideliu kampu, kad trachėja būtų horizontaliai išlygiuota rentgeno vaizde, kaip parodyta 2a paveiksle.
a) In vivo vaizdavimo sąranka SPring-8 vaizdo gavimo bloke, rentgeno spindulių kelias pažymėtas raudona punktyrine linija.( b, c ) Trachėjos magneto lokalizacija buvo atlikta nuotoliniu būdu, naudojant dvi ortogoniškai sumontuotas IP kameras.Kairėje ekrano vaizdo pusėje galite pamatyti vielos kilpą, laikančią galvutę, ir ET vamzdžio viduje įmontuotą tiekimo kaniulę.
Nuotoliniu būdu valdoma švirkšto siurblio sistema (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL), naudojanti 100 µl stiklinį švirkštą, buvo prijungta prie PE10 vamzdelio (0,61 mm OD, 0,28 mm ID), naudojant 30 Ga adatą.Pažymėkite vamzdelį, kad įsitikintumėte, jog galiukas trachėjoje yra teisingoje padėtyje, kai įkišamas endotrachėjinis vamzdelis.Naudojant mikrosiurblį, švirkšto stūmoklis buvo pašalintas, o vamzdelio galas buvo panardintas į MP mėginį, kuris turi būti pristatytas.Tada pakrautas tiekimo vamzdelis buvo įkištas į endotrachėjinį vamzdelį, antgalį pastatant į stipriausią tikėtino taikomo magnetinio lauko vietą.Vaizdo gavimas buvo valdomas naudojant kvėpavimo detektorių, prijungtą prie mūsų Arduino pagrindu veikiančio laiko dėžutės, o visi signalai (pvz., temperatūra, kvėpavimas, užrakto atidarymas / uždarymas ir vaizdo gavimas) buvo įrašyti naudojant „Powerlab“ ir „LabChart“ („AD Instruments“, Sidnėjus, Australija). 22 Vaizdo gavimas Kai korpusas buvo nepasiekiamas, dvi IP kameros (Panasonic BB-SC382) buvo išdėstytos maždaug 90° viena kitos atžvilgiu ir buvo naudojamos valdyti magneto padėtį trachėjos atžvilgiu vaizdavimo metu (2b pav., c).Siekiant sumažinti judesio artefaktus, galutinio kvėpavimo srauto plokščiakalnio metu buvo gautas vienas vaizdas kiekvienam įkvėpimui.
Magnetas pritvirtintas prie antrosios pakopos, kuri gali būti nuotoliniu būdu vaizdo gavimo korpuso išorėje.Buvo išbandytos įvairios magneto padėtys ir konfigūracijos, įskaitant: padėtą ​​maždaug 30° kampu virš trachėjos (konfigūracijos parodytos 2a ir 3a paveiksluose);vienas magnetas virš gyvūno, o kitas žemiau, o poliai nustatyti pritraukimui (3b pav.)., vienas magnetas virš gyvūno ir vienas žemiau, o poliai nustatyti atbaidymui (3c pav.), o vienas magnetas virš trachėjos ir statmenai jai (3d pav.).Nustatę gyvūną ir magnetą ir įdėję bandomąjį MP į švirkšto pompą, gavę vaizdus suleiskite 50 µl dozę 4 µl/s greičiu.Tada magnetas perkeliamas pirmyn ir atgal išilgai trachėjos arba per ją, o toliau gaunami vaizdai.
Magneto konfigūracija in vivo vaizdavimui a) vienas magnetas virš trachėjos maždaug 30° kampu, b) du magnetai, sukonfigūruoti pritraukti, c) du magnetai, sukonfigūruoti atbaidyti, d) vienas magnetas virš trachėjos ir statmenai jai. trachėjos.Stebėtojas pažvelgė žemyn iš burnos į plaučius per trachėją, o rentgeno spindulys praėjo per kairę žiurkės pusę ir išėjo iš dešinės pusės.Magnetas perkeliamas išilgai kvėpavimo takų arba kairėn ir dešinėn virš trachėjos rentgeno spindulio kryptimi.
Taip pat siekėme nustatyti dalelių matomumą ir elgesį kvėpavimo takuose, kai kvėpavimas ir širdies ritmas nesimaišo.Todėl vaizdavimo laikotarpio pabaigoje gyvūnai buvo humaniškai numarinti dėl pentobarbitalio perdozavimo (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, JAV; ~65 mg/kg ip).Kai kurie gyvūnai buvo palikti vaizdavimo platformoje, o sustojus kvėpavimui ir širdies plakimui, vaizdo gavimo procesas buvo pakartotas, pridėjus papildomą MP dozę, jei MP nebuvo matoma kvėpavimo takų paviršiuje.
Gauti vaizdai buvo pataisyti pagal plokščią ir tamsų lauką, o tada surinkti į filmą (20 kadrų per sekundę; 15–25 × normalus greitis, priklausomai nuo kvėpavimo dažnio), naudojant pasirinktinį scenarijų, parašytą MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Visi KS genų vektoriaus pristatymo tyrimai buvo atlikti Adelaidės universiteto laboratorinių gyvūnų tyrimų centre ir jų tikslas buvo panaudoti eksperimento SPring-8 rezultatus siekiant įvertinti, ar LV-MP pristatymas esant magnetiniam laukui gali sustiprinti genų perdavimą in vivo. .Siekiant įvertinti MF ir magnetinio lauko poveikį, buvo gydomos dvi gyvūnų grupės: vienai grupei buvo sušvirkštas LV MF su magneto įdėjimu, o kitai grupei - kontrolinei grupei LV MF be magneto.
LV genų vektoriai buvo sukurti naudojant anksčiau aprašytus metodus 25, 26 .LacZ vektorius išreiškia branduolyje lokalizuotą beta-galaktozidazės geną, kurį varo MPSV konstitucinis promotorius (LV-LacZ), kuris gamina mėlyną reakcijos produktą transdukuotose ląstelėse, matomą plaučių audinio priekyje ir dalyse.Titravimas buvo atliktas ląstelių kultūrose rankiniu būdu skaičiuojant LacZ teigiamų ląstelių skaičių, naudojant hemocitometrą, kad būtų galima apskaičiuoti titrą TU/ml.Nešikliai šaldomi -80°C temperatūroje, prieš naudojimą atšildomi ir sujungiami su CombiMag maišant santykiu 1:1 ir inkubuojant ant ledo mažiausiai 30 minučių prieš pristatymą.
Įprastos Sprague Dawley žiurkės (n = 3 grupėje, ~ 2-3 anestezuotos ip su 0,4 mg/kg medetomidino (Domitor, Ilium, Australija) ir 60 mg/kg ketamino (Ilium, Australija) mišiniu 1 mėnesio amžiaus) ip. ) injekcija ir nechirurginė burnos kaniulė 16 Ga intravenine kaniule.Siekiant užtikrinti, kad trachėjos kvėpavimo takų audinys gautų LV transdukciją, jis buvo kondicionuojamas naudojant anksčiau aprašytą mechaninio trikdymo protokolą, pagal kurį trachėjos kvėpavimo takų paviršius ašine kryptimi buvo trinamas vielos krepšeliu (N-Circle, nitinolio akmens ekstraktorius be antgalio NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, JAV) 30 p28.Tada, praėjus maždaug 10 minučių po sutrikimo biologinės saugos kabinete, buvo atliktas LV-MP trachėjos vartojimas.
Šiame eksperimente naudojamas magnetinis laukas buvo sukonfigūruotas panašiai kaip in vivo rentgeno tyrimas, kai tie patys magnetai buvo laikomi virš trachėjos distiliavimo stento spaustukais (4 pav.).50 µl tūris (2 x 25 µl alikvotinės dalys) LV-MP buvo tiekiamas į trachėją (n = 3 gyvūnai), naudojant pipetę su geliu, kaip aprašyta anksčiau.Kontrolinė grupė (n = 3 gyvūnai) gavo tą patį LV-MP nenaudojant magneto.Užbaigus infuziją, kaniulė išimama iš endotrachėjinio vamzdelio ir gyvūnas ekstubuojamas.Magnetas lieka vietoje 10 minučių, kol jį išima.Žiurkėms po oda buvo sušvirkšta meloksikamo (1 ml/kg) (Ilium, Australija), po to anestezija buvo nutraukta į pilvaplėvės ertmę suleidžiant 1 mg/kg atipamazolio hidrochlorido (Antisedan, Zoetis, Australija).Žiurkės buvo laikomos šiltai ir stebimos tol, kol visiškai atsigavo po anestezijos.
LV-MP pristatymo įrenginys biologinės saugos spintoje.Matote, kad ET vamzdelio šviesiai pilka Luer-lock įvorė išsikiša iš burnos, o paveikslėlyje parodytas gelio pipetės antgalis per ET vamzdelį įkišamas į norimą gylį į trachėją.
Praėjus savaitei po LV-MP vartojimo, gyvūnai buvo humaniškai nužudyti įkvėpus 100% CO2, o LacZ ekspresija buvo įvertinta naudojant standartinį X-gal gydymą.Trys labiausiai uodegos kremzlės žiedai buvo pašalinti siekiant užtikrinti, kad į analizę nebūtų įtraukti mechaniniai pažeidimai ar skysčių susilaikymas dėl endotrachėjinio vamzdelio įdėjimo.Kiekviena trachėja buvo perpjauta išilgai, kad būtų gautos dvi pusės analizei, ir įdėta į puodelį su silikonine guma (Sylgard, Dow Inc), naudojant Minutien adatą (Fine Science Tools), kad būtų galima vizualizuoti luminalinį paviršių.Transdukuotų ląstelių pasiskirstymas ir pobūdis buvo patvirtinti priekine fotografija naudojant Nikon mikroskopą (SMZ1500) su DigiLite kamera ir TCapture programine įranga (Tucsen Photonics, Kinija).Vaizdai buvo gauti 20 kartų padidinus (įskaitant maksimalų viso trachėjos pločio nustatymą), o visas trachėjos ilgis rodomas žingsnis po žingsnio, užtikrinant pakankamą kiekvieno vaizdo persidengimą, kad būtų galima „susiūti“ vaizdus.Tada vaizdai iš kiekvienos trachėjos buvo sujungti į vieną sudėtinį vaizdą, naudojant Composite Image Editor 2.0.3 versiją („Microsoft Research“), naudojant plokštuminio judesio algoritmą. LacZ ekspresijos plotas sudėtiniuose kiekvieno gyvūno trachėjos vaizduose buvo kiekybiškai įvertintas naudojant automatinį MATLAB scenarijų (R2020a, MathWorks), kaip aprašyta anksčiau28, naudojant nustatymus 0,35 <Atspalvis <0,58, sodrumas> 0,15 ir reikšmė < 0,7. LacZ ekspresijos plotas sudėtiniuose kiekvieno gyvūno trachėjos vaizduose buvo kiekybiškai įvertintas naudojant automatinį MATLAB scenarijų (R2020a, MathWorks), kaip aprašyta anksčiau28, naudojant parametrus 0,35 <Atspalvis <0,58, sodrumas> 0,15 ir vertė <0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. LacZ ekspresijos plotas sudėtiniuose kiekvieno gyvūno trachėjos vaizduose buvo kiekybiškai įvertintas naudojant automatinį MATLAB scenarijų (R2020a, MathWorks), kaip aprašyta anksčiau28, naudojant 0,35 nustatymus.0,15, o vertė <0 ,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ 表达区域进行量化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化 ， 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。。 。……………………………………. Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . LacZ išraiškos sritys sudėtiniuose kiekvieno gyvūno trachėjos vaizduose buvo kiekybiškai įvertintos naudojant automatinį MATLAB scenarijų (R2020a, MathWorks), kaip aprašyta anksčiau, naudojant nustatymus 0,35 < atspalvis < 0,58, sodrumas> 0,15 ir vertė < 0,7 .Stebint audinių kontūrus GIMP v2.10.24, kiekvienam sudėtiniam vaizdui buvo rankiniu būdu sukurta kaukė, siekiant nustatyti audinio sritį ir užkirsti kelią bet kokiems klaidingiems aptikimams už trachėjos audinio ribų.Visų sudėtinių kiekvieno gyvūno vaizdų nudažytos sritys buvo susumuotos, kad būtų gautas bendras to gyvūno dažytas plotas.Tada nudažytas plotas buvo padalintas iš viso kaukės ploto, kad būtų gautas normalizuotas plotas.
Kiekviena trachėja buvo įterpta į parafiną ir perpjauta 5 µm storio.Pjūviai 5 minutes buvo nudažyti neutralia greita raudona spalva, o vaizdai buvo gauti naudojant Nikon Eclipse E400 mikroskopą, DS-Fi3 kamerą ir NIS elementų fiksavimo programinę įrangą (5.20.00 versija).
Visos statistinės analizės buvo atliktos naudojant „GraphPad Prism v9“ („GraphPad Software, Inc.“).Statistinis reikšmingumas nustatytas p ≤ 0,05.Normalumas buvo išbandytas naudojant Shapiro-Wilk testą, o LacZ dažymo skirtumai buvo įvertinti naudojant nesuporuotą t testą.
Šeši 1 lentelėje aprašyti MP buvo ištirti PCXI, o matomumas aprašytas 2 lentelėje. Dviejų polistireno MP (MP1 ir MP2; 18 µm ir 0,25 µm atitinkamai) PCXI nematė, tačiau likusius mėginius buvo galima identifikuoti. (pavyzdžiai pateikti 5 pav.).MP3 ir MP4 yra silpnai matomi (atitinkamai 10-15% Fe3O4; 0,25 µm ir 0,9 µm).Nors MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 µm) buvo mažiausių testuotų dalelių, jis buvo ryškiausias.CombiMag MP6 gaminį sunku atskirti.Visais atvejais mūsų gebėjimas aptikti MF buvo labai pagerintas judant magnetą pirmyn ir atgal lygiagrečiai kapiliarui.Magnetams tolstant nuo kapiliaro, dalelės buvo ištrauktos ilgomis grandinėmis, tačiau artėjant magnetams ir didėjant magnetinio lauko stiprumui, dalelių grandinės sutrumpėjo, nes dalelės migravo link viršutinio kapiliaro paviršiaus (žr. papildomą vaizdo įrašą S1 : MP4), didinant dalelių tankį paviršiuje.Ir atvirkščiai, kai magnetas pašalinamas iš kapiliaro, lauko stiprumas sumažėja ir MP persitvarko į ilgas grandines, besitęsiančias nuo viršutinio kapiliaro paviršiaus (žr. Papildomą vaizdo įrašą S2: MP4).Magnetui nustojus judėti, pasiekusios pusiausvyros padėtį dalelės dar kurį laiką juda.Kai MP juda link viršutinio kapiliaro paviršiaus ir nuo jo, magnetinės dalelės linkusios ištraukti šiukšles per skystį.
MP matomumas naudojant PCXI labai skiriasi tarp pavyzdžių.a) MP3, b) MP4, c) MP5 ir d) MP6.Visi čia pateikti vaizdai buvo padaryti naudojant magnetą, esantį maždaug 10 mm tiesiai virš kapiliaro.Akivaizdūs dideli apskritimai yra kapiliaruose įstrigę oro burbuliukai, aiškiai parodantys fazinio kontrasto vaizdo juodos ir baltos krašto ypatybes.Raudonas langelis rodo padidinimą, kuris padidina kontrastą.Atkreipkite dėmesį, kad magnetų grandinių skersmenys visuose paveikslėliuose neatitinka mastelio ir yra maždaug 100 kartų didesni nei parodyta.
Kai magnetas juda į kairę ir į dešinę išilgai kapiliaro viršaus, MP stygos kampas pasikeičia taip, kad jis susilygintų su magnetu (žr. 6 pav.), taip nubrėždamas magnetinio lauko linijas.MP3-5 atveju, kai styga pasiekia slenkstinį kampą, dalelės velkasi išilgai viršutinio kapiliaro paviršiaus.Dėl to MP dažnai susiskirsto į didesnes grupes netoli tos vietos, kur stipriausias magnetinis laukas (žr. papildomą vaizdo įrašą S3: MP5).Tai taip pat ypač akivaizdu, kai vaizdas yra arti kapiliaro galo, dėl kurio MP agreguojasi ir susikoncentruoja skysčio ir oro sąsajoje.MP6 dalelės, kurias buvo sunkiau atskirti nei MP3-5, nevilko, kai magnetas judėjo palei kapiliarą, tačiau MP stygos atsiskyrė, palikdamos daleles akyse (žr. Papildomą vaizdo įrašą S4: MP6).Kai kuriais atvejais, kai taikomas magnetinis laukas buvo sumažintas perkeliant magnetą dideliu atstumu nuo vaizdo gavimo vietos, visi likę MP gravitacijos dėka lėtai nusileido į apatinį vamzdžio paviršių, likdami stygoje (žr. papildomą vaizdo įrašą S5: MP3) .
MP stygos kampas keičiasi, kai magnetas juda į dešinę virš kapiliaro.a) MP3, b) MP4, c) MP5 ir d) MP6.Raudonas langelis rodo padidinimą, kuris padidina kontrastą.Atkreipkite dėmesį, kad papildomi vaizdo įrašai skirti informaciniams tikslams, nes juose atskleidžiama svarbi dalelių struktūra ir dinamiška informacija, kurios negalima vizualizuoti šiuose statiniuose vaizduose.
Mūsų bandymai parodė, kad magneto judėjimas pirmyn ir atgal išilgai trachėjos palengvina MF vizualizavimą sudėtingo judėjimo in vivo kontekste.In vivo bandymai nebuvo atlikti, nes polistireno granulės (MP1 ir MP2) kapiliare nebuvo matomos.Kiekvienas iš likusių keturių MF buvo išbandytas in vivo, kai ilgoji magneto ašis buvo virš trachėjos maždaug 30° kampu vertikalios atžvilgiu (žr. 2b ir 3a paveikslus), nes dėl to MF grandinės buvo ilgesnės ir buvo efektyvesnis. nei magnetas..konfigūracija nutraukta.MP3, MP4 ir MP6 nebuvo rasta jokių gyvų gyvūnų trachėjoje.Vizualizuojant žiurkių kvėpavimo takus, humaniškai nužudžius gyvūnus, dalelės liko nematomos net pridėjus papildomo tūrio naudojant švirkšto pompą.MP5 turėjo didžiausią geležies oksido kiekį ir buvo vienintelė matoma dalelė, todėl ji buvo naudojama MP elgesiui in vivo įvertinti ir apibūdinti.
Magneto padėjimas virš trachėjos MF įterpimo metu lėmė tai, kad daugelis, bet ne visi, MF buvo sutelkti regėjimo lauke.Dalelių patekimas į trachėją geriausiai stebimas humaniškai numarintų gyvūnų atveju.7 paveikslas ir papildomas vaizdo įrašas S6: MP5 rodo greitą magnetinį fiksavimą ir dalelių išlyginimą ventralinės trachėjos paviršiuje, o tai rodo, kad MP gali būti nukreipti į norimas trachėjos sritis.Ieškant distaliau išilgai trachėjos po MF pristatymo, kai kurie MF buvo rasti arčiau karinos, o tai rodo, kad magnetinio lauko stiprumas nepakankamas visiems MF surinkti ir laikyti, nes jie buvo tiekiami per didžiausio magnetinio lauko stiprumo sritį skysčio vartojimo metu.procesas.Tačiau postnatalinės MP koncentracijos buvo didesnės vaizdo srityje, o tai rodo, kad daugelis MP liko kvėpavimo takų regionuose, kur buvo didžiausias magnetinio lauko stiprumas.
Vaizdai (a) prieš ir (b) po MP5 pristatymo į neseniai eutanazuotos žiurkės trachėją su magnetu, esančiu tiesiai virš vaizdavimo srities.Pavaizduota sritis yra tarp dviejų kremzlinių žiedų.Prieš pristatant MP, kvėpavimo takuose yra šiek tiek skysčio.Raudonas langelis rodo padidinimą, kuris padidina kontrastą.Šie vaizdai paimti iš vaizdo įrašo, pateikto S6: MP5 papildomame vaizdo įraše.
Perkeliant magnetą išilgai trachėjos in vivo, MP grandinės kampas kvėpavimo takų paviršiuje pasikeitė, panašus į tą, kuris pastebėtas kapiliaruose (žr. 8 paveikslą ir papildomą vaizdo įrašą S7: MP5).Tačiau mūsų tyrime MP negalėjo vilkti gyvų kvėpavimo takų paviršiumi, kaip galėtų padaryti kapiliarai.Kai kuriais atvejais MP grandinė pailgėja, kai magnetas juda į kairę ir į dešinę.Įdomu tai, kad mes taip pat nustatėme, kad dalelių grandinė keičia skysčio paviršiaus sluoksnio gylį, kai magnetas judinamas išilgai išilgai trachėjos, ir plečiasi, kai magnetas perkeliamas tiesiai virš galvos ir dalelių grandinė pasukama į vertikalią padėtį (žr. Papildomas vaizdo įrašas S7).: MP5 0:09, apačioje dešinėje).Būdingas judėjimo modelis pasikeitė, kai magnetas buvo perkeltas į šoną per trachėjos viršų (ty į kairę arba į dešinę nuo gyvūno, o ne išilgai trachėjos).Judėjimo metu dalelės vis dar buvo aiškiai matomos, tačiau pašalinus magnetą iš trachėjos, tapo matomi dalelių stygų galiukai (žr. Papildomą vaizdo įrašą S8: MP5, pradedant nuo 0:08).Tai atitinka stebimą magnetinio lauko elgseną veikiant stiklo kapiliare veikiančiam magnetiniam laukui.
Vaizdų pavyzdžiai, rodantys MP5 gyvos anestezuotos žiurkės trachėjoje.(a) Magnetas naudojamas vaizdams gauti aukščiau ir kairėje trachėjos pusėje, tada (b) perkėlus magnetą į dešinę.Raudonas langelis rodo padidinimą, kuris padidina kontrastą.Šie vaizdai yra iš vaizdo įrašo, pateikto S7 papildomame vaizdo įraše: MP5.
Kai du poliai buvo suderinti šiaurės-pietų kryptimi virš ir žemiau trachėjos (ty traukiantys; 3b pav.), MP stygos pasirodė ilgesnės ir buvo ant šoninės trachėjos sienelės, o ne ant nugaros paviršiaus. trachėja (žr. priedą).Vaizdo įrašas S9: MP5).Tačiau didelės dalelių koncentracijos vienoje vietoje (ty trachėjos nugariniame paviršiuje) nebuvo aptiktos po skysčio įvedimo naudojant dvigubo magneto įtaisą, o tai paprastai būna naudojant vieną magnetą.Tada, kai vienas magnetas buvo sukonfigūruotas taip, kad atstumtų priešingus polius (3c pav.), matymo lauke matomų dalelių skaičius po pristatymo nepadidėjo.Abiejų magnetų konfigūracijų nustatymas yra sudėtingas dėl didelio magnetinio lauko stiprumo, kuris atitinkamai pritraukia arba stumia magnetus.Tada sąranka buvo pakeista į vieną magnetą, lygiagrečiai kvėpavimo takams, bet einantį per kvėpavimo takus 90 laipsnių kampu, kad jėgos linijos kerta trachėjos sienelę statmenai (3d pav.), orientacija, skirta nustatyti dalelių agregacijos galimybę. šoninė siena.būti stebimas.Tačiau šioje konfigūracijoje nebuvo identifikuojamo MF kaupimo judėjimo ar magneto judėjimo.Remiantis visais šiais rezultatais, genų nešėjų tyrimams in vivo buvo pasirinkta konfigūracija su vienu magnetu ir 30 laipsnių orientacija (3a pav.).
Kai gyvūnas buvo vaizduojamas kelis kartus iškart po to, kai buvo humaniškai paaukotas, trukdančio audinio judėjimo nebuvimas reiškė, kad aiškiame tarpkremzliniame lauke buvo galima pastebėti smulkesnes, trumpesnes dalelių linijas, „siūbuojančias“ pagal magneto transliacinį judėjimą.aiškiai matyti MP6 dalelių buvimą ir judėjimą.
LV-LacZ titras buvo 1,8 x 108 TV/ml, o sumaišius 1:1 su CombiMag MP (MP6), gyvūnams buvo sušvirkšta 50 µl trachėjos dozės 9 x 107 TV/ml LV nešiklio (ty 4,5). x 106 TU/žiurkei).).).Šiuose tyrimuose, užuot judinę magnetą gimdymo metu, fiksavome magnetą vienoje padėtyje, kad nustatytų, ar LV transdukcija gali būti (a) patobulinta, palyginti su vektoriaus tiekimu, kai nėra magnetinio lauko, ir (b) ar kvėpavimo takai galėtų būti susikaupusiam.Ląstelės transdukuojamos viršutinių kvėpavimo takų magnetinėse tikslinėse srityse.
Magnetų buvimas ir CombiMag naudojimas kartu su KS vektoriais neturėjo neigiamo poveikio gyvūnų sveikatai, kaip ir mūsų standartinis KS vektoriaus pristatymo protokolas.Priekiniai trachėjos srities, paveiktos mechaniniu trikdymu, vaizdai (papildomas 1 pav.) parodė, kad LV-MP gydytos grupės transdukcijos lygis buvo žymiai didesnis esant magnetui (9a pav.).Kontrolinėje grupėje buvo tik nedidelis mėlynos spalvos LacZ dažymas (9b pav.).X-Gal nudažytų normalizuotų sričių kiekybinis įvertinimas parodė, kad LV-MP skyrimas esant magnetiniam laukui pagerino maždaug 6 kartus (9c pav.).
Sudėtinių vaizdų, rodančių trachėjos transdukciją naudojant LV-MP (a) esant magnetiniam laukui ir (b) nesant magneto, pavyzdys.c) Statistiškai reikšmingas normalizuotos LacZ transdukcijos srities pagerėjimas trachėjoje naudojant magnetą (*p = 0,029, t-testas, n = 3 grupėje, vidurkis ± standartinė vidurkio paklaida).
Neutralios, greitai raudonai nudažytos sekcijos (pavyzdys parodytas papildomame 2 paveiksle) parodė, kad LacZ dažytos ląstelės buvo tame pačiame mėginyje ir toje pačioje vietoje, kaip buvo pranešta anksčiau.
Pagrindinis kvėpavimo takų genų terapijos iššūkis išlieka tikslus nešiklio dalelių lokalizavimas dominančiose srityse ir aukšto lygio transdukcijos efektyvumas mobiliuosiuose plaučiuose esant oro srautui ir aktyviam gleivių klirensui.KS nešiotojams, skirtiems kvėpavimo takų ligoms gydyti sergant cistine fibroze, nešiklio dalelių buvimo laiko laidžiuose kvėpavimo takuose padidinimas iki šiol buvo nepasiekiamas tikslas.Kaip nurodė Castellani ir kt., magnetinių laukų naudojimas transdukcijai sustiprinti turi pranašumų, palyginti su kitais genų pristatymo metodais, tokiais kaip elektroporacija, nes jis gali derinti paprastumą, ekonomiškumą, lokalizuotą pristatymą, didesnį efektyvumą ir trumpesnį inkubacijos laiką.ir galbūt mažesnė nešiklio dozė10.Tačiau magnetinių dalelių nusėdimas ir elgsena kvėpavimo takuose in vivo, veikiant išorinėms magnetinėms jėgoms, niekada nebuvo aprašyta, o iš tikrųjų šio metodo gebėjimas padidinti genų ekspresijos lygį nepažeistuose gyvuose kvėpavimo takuose nebuvo įrodytas in vivo.
Mūsų in vitro eksperimentai su PCXI sinchrotronu parodė, kad visos mūsų išbandytos dalelės, išskyrus MP polistireną, buvo matomos mūsų naudojamoje vaizdavimo sąrankoje.Esant magnetiniam laukui, magnetiniai laukai sudaro stygas, kurių ilgis priklauso nuo dalelių tipo ir magnetinio lauko stiprumo (ty magneto artumo ir judėjimo).Kaip parodyta 10 paveiksle, mūsų stebimos stygos susidaro, kai kiekviena atskira dalelė įmagnetinama ir sukelia savo vietinį magnetinį lauką.Dėl šių atskirų laukų kitos panašios dalelės susirenka ir susijungia su grupės stygų judesiais dėl vietinių jėgų, atsirandančių dėl vietinių kitų dalelių traukos ir atstūmimo jėgų.
Diagrama, kurioje parodyta (a, b) dalelių grandinės, susidarančios skysčio pripildytų kapiliarų viduje, ir (c, d) oro užpildyta trachėja.Atkreipkite dėmesį, kad kapiliarai ir trachėja nėra traukiami pagal mastelį.Skydelyje (a) taip pat yra MF, kuriame yra Fe3O4 dalelių, išdėstytų grandinėmis, aprašymas.
Kai magnetas judėjo virš kapiliaro, dalelių stygos kampas pasiekė kritinę MP3-5, turinčio Fe3O4, ribą, po kurios dalelių eilutė nebeliko pradinėje padėtyje, o judėjo išilgai paviršiaus į naują padėtį.magnetas.Šis poveikis greičiausiai atsiranda dėl to, kad stiklo kapiliaro paviršius yra pakankamai lygus, kad galėtų įvykti šis judėjimas.Įdomu tai, kad MP6 (CombiMag) taip nesielgė, galbūt todėl, kad dalelės buvo mažesnės, turėjo skirtingą dangą ar paviršiaus krūvį arba patentuotas nešiklio skystis paveikė jų gebėjimą judėti.CombiMag dalelių vaizdo kontrastas taip pat yra silpnesnis, o tai rodo, kad skysčio ir dalelių tankis gali būti toks pat ir todėl negali lengvai judėti vienas kito link.Dalelės taip pat gali įstrigti, jei magnetas juda per greitai, o tai rodo, kad magnetinio lauko stiprumas ne visada gali įveikti trintį tarp skysčio dalelių, o tai rodo, kad magnetinio lauko stiprumas ir atstumas tarp magneto ir tikslinės srities neturėtų būti siurprizas.svarbu.Šie rezultatai taip pat rodo, kad nors magnetai gali užfiksuoti daug mikrodalelių, tekančių per tikslinę sritį, mažai tikėtina, kad magnetais galima pasikliauti CombiMag dalelėmis išilgai trachėjos paviršiaus.Taigi padarėme išvadą, kad in vivo LV MF tyrimai turėtų naudoti statinius magnetinius laukus, kad būtų galima fiziškai nukreipti konkrečias kvėpavimo takų medžio sritis.
Kai dalelės patenka į kūną, jas sunku atpažinti sudėtingo judančio kūno audinio kontekste, tačiau jų aptikimo galimybė buvo patobulinta perkeliant magnetą horizontaliai per trachėją, kad „judėtų“ MP stygos.Nors realaus laiko vaizdavimas yra įmanomas, lengviau pastebėti dalelių judėjimą po to, kai gyvūnas buvo humaniškai nužudytas.MP koncentracija paprastai buvo didžiausia šioje vietoje, kai magnetas buvo pastatytas virš vaizdavimo srities, nors kai kurios dalelės paprastai buvo aptinkamos toliau trachėjoje.Skirtingai nei tyrimai in vitro, dalelės negali būti nutemptos trachėja, judant magnetu.Ši išvada sutampa su tuo, kaip trachėjos paviršių dengiančios gleivės paprastai apdoroja įkvėptas daleles, sulaiko jas gleivėse ir vėliau pašalina jas per gleivinės ir ciliarinio klirenso mechanizmą.
Iškėlėme hipotezę, kad naudojant magnetus virš ir žemiau trachėjos pritraukimui (3b pav.), galima gauti tolygesnį magnetinį lauką, o ne labai koncentruotą viename taške, todėl dalelės gali pasiskirstyti tolygiau..Tačiau mūsų preliminarus tyrimas nerado aiškių įrodymų, patvirtinančių šią hipotezę.Panašiai nustačius magnetų porą atstumti (3c pav.), vaizdo srityje daugiau dalelių nenusėdo.Šios dvi išvados rodo, kad dviejų magnetų sąranka žymiai nepagerina vietinio MP nukreipimo valdymo ir kad dėl to atsirandančias stiprias magnetines jėgas sunku suderinti, todėl šis metodas yra mažiau praktiškas.Panašiai, nukreipus magnetą virš trachėjos ir skersai jos (3d pav.), taip pat nepadidėjo dalelių, likusių vaizduojamoje srityje, skaičius.Kai kurios iš šių alternatyvių konfigūracijų gali būti nesėkmingos, nes dėl jų nusodinimo zonoje sumažėja magnetinio lauko stiprumas.Taigi vieno magneto konfigūracija esant 30 laipsnių kampui (3a pav.) yra laikoma paprasčiausiu ir efektyviausiu in vivo testavimo metodu.
LV-MP tyrimas parodė, kad kai KS vektoriai buvo derinami su CombiMag ir buvo pristatyti po fizinio trikdymo esant magnetiniam laukui, transdukcijos lygis trachėjoje žymiai padidėjo, palyginti su kontrolinėmis grupėmis.Remiantis sinchrotrono vaizdavimo tyrimais ir LacZ rezultatais, atrodė, kad magnetinis laukas gali išlaikyti LV trachėjoje ir sumažinti vektorinių dalelių, kurios iš karto prasiskverbė giliai į plaučius, skaičių.Tokie tikslinimo patobulinimai gali padidinti efektyvumą, tuo pačiu sumažinant pristatytus titrus, netikslinę transdukciją, uždegiminį ir imuninį šalutinį poveikį bei genų perdavimo išlaidas.Svarbu tai, kad, pasak gamintojo, CombiMag gali būti naudojamas kartu su kitais genų perdavimo metodais, įskaitant kitus virusinius vektorius (pvz., AAV) ir nukleorūgštis.