Dvylikapirštės žarnos žiardija yra parazitinis organizmas, sukeliantis giardiazę – žarnyno infekciją, ypač dažną mažiems vaikams, turintiems klinikinių viduriavimo požymių.Jau anksčiau pranešėme, kad tarpląstelinis G. duodenalis suaktyvina į ląstelinį oligomerizaciją panašų receptorių 3 (NLRP3) surišančius nukleotidus ir reguliuoja šeimininko uždegiminius atsakus per ekstraląstelinės pūslelės (EV) sekreciją.Tačiau dar reikia išsiaiškinti tikslius su patogenu susijusio duodenokokinio EV (GEV), dalyvaujančio šiame procese, molekulinius modelius ir NLRP3 uždegimo vaidmenį sergant giardiaze.
Rekombinantinės eukariotinės ekspresijos plazmidės pcDNA3.1(+)-alfa-2 ir alfa-7.3 giardinai GEV buvo sukonstruotos, transfekuotos į pelės pirminius pilvaplėvės makrofagus ir aptiktos išmatuojant uždegimo tikslinę molekulę kaspazę-1.Buvo patikrintas p20 ekspresijos lygis..G. duodenalis alfa-2 ir alfa-7.3 giardinai iš pradžių buvo identifikuoti matuojant NLRP3 uždegiminę (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-kaspazės-1 ir kaspazės-1 p20), IL sekreciją.1β lygiai, apoptozinio dėmėtojo baltymo (ASC) oligomerizacijos lygiai ir imunofluorescencinė NLRP3 ir ASC lokalizacija.Tada buvo įvertintas NLRP3 uždegimo vaidmuo G. duodenalis patogeniškumui naudojant peles, kurioms NLRP3 aktyvacija buvo blokuota (NLRP3 blokuotos pelės) ir buvo stebimi patologiniai kūno svorio pokyčiai, dvylikapirštės žarnos parazitų apkrova ir dvylikapirštės žarnos audinys.Be to, ištyrėme, ar hiardinai alfa-2 ir alfa-7.3 skatina IL-1β sekreciją in vivo per NLRP3 uždegimą ir nustatėme šių molekulių vaidmenį pelių G. duodenalis patogeniškumui.
Alfa-2 ir alfa-7.3 giardinai skatina NLRP3 uždegimo aktyvavimą in vitro.Dėl to suaktyvėjo p20 kaspazė-1, padidėjo NLRP3, pro-IL-1β ir pro-kaspazės-1 baltymų ekspresijos lygis, žymiai padidėjo IL-1β sekrecija, susidarė ASA dėmės. citoplazmą ir ASA oligomerizacijos indukciją.NLRP3 uždegimas Varpos praradimas padidina G. duodenalis patogeniškumą pelėms.Pelėms, kurios buvo gydomos cistomis zondu iš NLRP3 blokuotų pelių, pasireiškė padidėjęs trofozoitų skaičius ir didelis dvylikapirštės žarnos gaurelių pažeidimas, kuriam būdingos nekrozinės kriptos su susitraukusiomis ir išsišakojusiomis.In vivo eksperimentai parodė, kad giardinos alfa-2 ir alfa-7.3 gali sukelti IL-1β sekreciją per NLRP3 uždegimą, o imunizacija giardinomis alfa-2 ir alfa-7.3 sumažino G. duodenalis patogeniškumą pelėms.
Apibendrinant, šio tyrimo rezultatai rodo, kad giardia alfa-2 ir alfa-7.3 sukelia šeimininko NLRP3 uždegimo reguliavimą ir sumažina G. duodenalis užkrečiamumą pelėms, kurios yra perspektyvūs giardiazės prevencijos tikslai.
Giardia duodenum yra ekstraląstelinis pirmuonis parazitas, gyvenantis plonojoje žarnoje ir kasmet sukeliantis 280 milijonų giardiazės ir viduriavimo atvejų, ypač tarp mažų vaikų besivystančiose šalyse [1].Žmonės užsikrečia gerdami vandenį ar maistą, užterštą M. dvylikapirštės žarnos cistomis, kurios vėliau patenka į skrandį ir išsiskiria su skrandžio sultimis.Giardia dvylikapirštės žarnos trofozoitai prisitvirtina prie dvylikapirštės žarnos epitelio, sukelia pykinimą, vėmimą, viduriavimą, pilvo skausmą ir svorio mažėjimą.Asmenys, sergantys imunodeficitu ir cistine fibroze, yra jautrūs infekcijai.Infekcija taip pat gali atsirasti per oralinį ir analinį seksą [2].Tokie vaistai kaip metronidazolas, tinidazolas ir nitazoksanidas yra tinkamiausios dvylikapirštės žarnos infekcijų gydymo galimybės [3].Tačiau šie chemoterapiniai vaistai sukelia nepageidaujamą šalutinį poveikį, pavyzdžiui, pykinimą, kancerogenezę ir genotoksiškumą [4].Todėl reikia sukurti veiksmingesnes G. duodenalis infekcijos prevencijos strategijas.
Inflammasomos yra citozolinių baltymų kompleksų klasė, kuri yra įgimto imuninio atsako dalis, padeda apsisaugoti nuo patogenų invazijos ir tarpininkauja uždegiminiams atsakams [5].Tarp šių uždegimų, nukleotidus surišančios oligomerizacijos (NOD) receptoriaus 3 (NLRP3) nukleotidus surišančios oligomerizacijos (NLRP3) nukleotidus surišančios uždegimo formos buvo plačiai ištirtos, nes ją galima aptikti įvairiais patogenais ir (arba) pažeidimais susijusiais molekuliniais modeliais (PAMP/). DAMP), atpažįsta, aktyvina įgimtą imuninę sistemą.ir reguliuoja žarnyno homeostazę sergant daugeliu uždegiminių ligų [6,7,8].Jį sudaro modelio atpažinimo receptorius (PRR) NLRP3, adapteris apoptozinis dėmėtasis baltymas (ASC) ir efektorinė prokaspazė-1 arba prokaspazė-11.NLRP3 uždegimas veikia kaip šeimininkas prieš patogenų invaziją, kaip pastebėta Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] ir Leishmania tyrimuose.[11], tačiau taip pat buvo pranešta, kad NLRP3 uždegimo aktyvinimas riboja apsauginį imuninį atsaką ir pablogina ligos progresavimą, pavyzdžiui, kirmėlių atveju [12].Remdamiesi ankstesniais atradimais, pranešėme, kad tarpląstelinis G. duodenalis sukelia tarpląstelinį NLRP3 uždegimą ir moduliuoja šeimininko uždegiminius atsakus išskirdamas tarpląstelines pūsleles (EV) [13].Tačiau NLRP3 uždegimo vaidmuo sergant G. duodenalis infekcija in vivo dar turi būti nustatytas.
Iš pradžių giardinai buvo apibūdinti kaip struktūriniai G. duodenalis citoskeleto komponentai ir vaidina svarbų vaidmenį trofozoitų judrumui ir epitelio ląstelių prisitvirtinimui plonojoje žarnoje.Kad geriau prisitaikytų prie aplinkos ir padidintų savo patogeniškumą, G. duodenalis trophozoites sukūrė unikalią citoskeleto struktūrą, susidedančią iš 8 žvynelių, 1 vidurinio kūno ir 1 ventralinio disko [14].Giardia duodenum trofozoidai naudoja savo citoskeletą, kad prasiskverbtų į viršutinę plonąją žarną, ypač į dvylikapirštę žarną, ir prisitvirtintų prie enterocitų.Jie nuolat migruoja ir prisitvirtina prie epitelio ląstelių, naudodamiesi ląstelių metabolizmu.Todėl yra glaudus ryšys tarp jų citoskeleto ir virulentiškumo.Giardinai būdingos dvylikapirštės žarnos giardinos yra citoskeleto struktūros komponentai [15] ir skirstomos į keturias klases: α-, β-, γ- ir δ-giardinas.Yra 21 α-giardinų šeimos narys, kurie visi turi nuo kalcio priklausomą gebėjimą surišti fosfolipidus [16].Jie taip pat jungia citoskeletą su ląstelės membrana.Asmenims, sergantiems G. duodenalis sukeltu viduriavimu, α-giardinai yra labai išreikšti ir imunoreaktyvūs infekcijos metu [17].Heterologinės vakcinos, pagrįstos Giardia alfa-1, apsaugojo nuo pelių giardiazės ir yra potencialūs vakcinos kūrimo antigenai [18].Alfa-8 giardinas, lokalizuotas plazminėje membranoje ir žvyneliuose, bet ne ventraliniame diske, padidina G. duodenalis trofozoitų judrumą ir augimo greitį [19].Alfa-14 giardinas prisitvirtina prie mikrotubulinių struktūrų ant žvynelių ir veikia G. duodenalis gyvybingumą [20].Alfa-11 giardino gausu per visą gyvavimo ciklą, o per didelė alfa-11 giardino ekspresija pažeidžia patį G. duodenalis [21].Tačiau neaišku, ar alfa-2 giardinas ir alfa-7,3 giardinas apsaugo nuo G. duodenalis infekcijos ir jų pagrindinių mechanizmų.
Šiame tyrime rekombinantinės eukariotinės ekspresijos plazmidės pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinas ir pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardinas buvo transfekuotos į pelės pirminius pilvaplėvės makrofagus, kad aktyvuotų šeimininką NLRP3.Tada buvo tikrinami uždegiminiai taikiniai.Taip pat įvertinome NLRP3 uždegimo vaidmenį G. duodenalis patogeniškumui, ištyrėme, ar alfa-2 ir alfa-7,3 giardinai skatina NLRP3 uždegimo aktyvavimą in vivo, ir nustatėme, kad šie du giardinų vaidmenys patogeniškume. G. duodenalis.Mūsų bendras tikslas buvo sukurti perspektyvius G. duodenalis infekcijos prevencijos tikslus.
Laukinio tipo (WT) C57BL/6 5–8 savaičių pelių patelės buvo įsigytos iš Liaoning Changsheng eksperimentinio gyvūnų centro (Liaoning, Kinija).Pelės turėjo laisvą prieigą prie vandens, gavo sterilizuotą maistą ir buvo laikomos 12/12 valandų šviesos / tamsos cikle.Prieš užsikrėtimą pelės gavo antibiotikų ad libitum geriamajame vandenyje, papildytame ampicilinu (1 mg/ml), vankomicinu (1 mg/ml) ir neomicinu (1,4 mg/ml) (visi pirkta iš Šanchajaus, Kinija, dirbtiniai organizmai) [22] ].].Pelės, praradusios galimybę valgyti ir gerti > 24 valandas ir netekusios ≥ 20 % kūno svorio, buvo humaniškai numarintos išnirstant gimdos kakleliui.
WB G. duodenalis trofozoitai (American Type Culture Collection, Manassas, JAV) buvo papildyti 12,5% galvijų vaisiaus serumo (FBS; Every Green, Zhejiang, China) ir 0,1% galvijų tulžies (Sigma-Aldrich, St. Missouri, JAV). ).JAV) mikroaerobinėmis sąlygomis.Susilieję trofozoitai buvo surinkti ant ledo ir pasėti santykiu 1:4 tolesniam dauginimuisi.
Giardia dvylikapirštės žarnos cistos buvo sukeltos, kaip aprašyta anksčiau [23], trofozoitai buvo surinkti logaritminėje fazėje ir praskiesti kapsuliavimą skatinančia terpe, pH 7,1 (modifikuotas TYI-S-33), iki galutinės koncentracijos 1 × 106 trofozoitų / ml.tulžies koncentracija 0,05 % terpė).Trofozoitai buvo auginami anaerobinėmis sąlygomis 37 ° C temperatūroje iki logaritminio augimo fazės.Keisti terpę į cistas sukeliančią terpę (pH 7,8; ​​modifikuota TYI-S-33 terpė su 1 % tulžies koncentracija) ir kultivuoti G. duodenalis 37°C temperatūroje 48–96 valandas, per kurias mikroskopu buvo stebimas cistų susidarymas.Po to, kai dauguma trofozoitų buvo paskatinti formuotis cistoms, kultūros mišinys buvo surinktas ir resuspenduojamas steriliame dejonizuotame vandenyje, kad būtų lizuojami likę trofozoitai.Cistos buvo suskaičiuotos ir laikomos 4 ° C temperatūroje, kad būtų galima atlikti tolesnius tyrimus per pelių skrandžio vamzdelį.
Giardia ekstraląstelinės pūslelės (GEV) buvo praturtintos, kaip aprašyta anksčiau [13].Trofozoitai logaritminėje augimo fazėje buvo pakartotinai suspenduoti modifikuotoje TYI-S-33 terpėje, paruoštoje su eksosomų išeikvotu FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Izraelis), iki galutinės koncentracijos 1 × 106 parazitų / ml ir inkubuojami 12 valandų.buvo išskirti iš kultūros supernatanto centrifuguojant 2000 g 10 min., 10 000 g 45 min. ir 100 000 g 60 min.Nuosėdos buvo ištirpintos fosfatiniame buferiniame fiziologiniame tirpale (PBS), kiekybiškai įvertintos naudojant BCA baltymų tyrimo rinkinį (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV) ir laikomos -80 °C temperatūroje arba tiesiogiai naudojamos tolimesnėms analizėms.
Pirminiai pelių pilvaplėvės makrofagai buvo paruošti, kaip aprašyta anksčiau [24].Trumpai tariant, pelėms (6–8 savaičių amžiaus) buvo sušvirkšta (intraperitoniniu būdu [ip]) 2, 5 ml 2, 98% Difco skystos tioglikolio terpės (BD, Franklin Lakes, NJ, JAV) ir šeriamos 3–4 gomuriais.Makrofagų suspensija buvo surinkta iš pelių pilvo ertmės po eutanazijos ir centrifuguojama 3 kartus 1000 g 10 min.Surinktos ląstelės buvo aptiktos srauto citometrijos metodu, naudojant CD11b žymeklį, kol ląstelių grynumas buvo > 98%, tada pridedamas prie 6 šulinėlių ląstelių kultūros plokštelių (4,5 x 106 ląstelės / duobutėje) ir inkubuojamos su 10% FBS (Bioindustry) 37 ° C temperatūroje.ir 5% CO2.
RNR buvo išskirta iš 1 × 107 trofozoitų 1 ml TRIzol reagento (Vazyme, Nanjing, Kinija), genominė DNR buvo išskirta iš visos G. duodenalis RNR naudojant MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Kinija) ir susintetinta komplementari DNR (cDNR). naudojant MonScript RTIIII Super Mix (Monad) pagal gamintojo instrukcijas.
Tikslinio G. duodenalis geno CDS sekos informacija buvo gauta iš NCBI GenBank.Naudokite Primer 5.0, kad sukurtumėte specifinius besiūlius klonavimo pradmenis kiekvienam tiksliniam genui.Priekinis pradmuo (5′-3′) susideda iš trijų dalių: persidengiančios sekos su tiesiniu vektoriumi pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) ir pradžios kodonais ATG ir GNN (jei pirmoji bazė nėra G).Tai daroma siekiant pagerinti išraiškos efektyvumą.Be to, ne mažiau kaip 16 bp kombinuotų bazių (GC kiekis 40–60 %/Tm apie 55 °C).Atvirkštinis pradmuo (5′-3′) susideda iš dviejų dalių, sutampančios sekos su EcoRV linijiniu vektoriumi pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) ir bent 16 bp kombinuotos bazės.(išskyrus paskutines dvi stoteles).bazės) kodoną, tokį kaip AA arba GA, kad rekombinantinės plazmidės galėtų išreikšti savo pažymėtus baltymus).Pradmenų sekos išvardytos 1 lentelėje ir jas susintetino Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Kinija).
Taikiniai buvo amplifikuoti naudojant Pfu DNR polimerazę (Tiangenas, Pekinas, Kinija) arba Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Pekinas, Kinija), naudojant paruoštą G. duodenalis cDNR kaip šabloną.Eukariotinės ekspresijos vektoriaus plazmidė pcDNA3.1(+) buvo linearizuota restrikcijos fermentu EcoRV ir defosforilinta naudojant Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Linearizuoti pcDNA3.1(+) fragmentai ir amplifikuoti tikslinio geno fragmentai buvo išgryninti naudojant DNR gelio gryninimo rinkinį (Tiangen) ir kiekybiškai įvertinti naudojant Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).pcDNA3.1(+) fragmentas ir kiekvienas tikslinio geno fragmentas buvo rekombinuoti naudojant MonClone vieno surinkimo klonavimo mišinį (Monad Biotech Co., Ltd., Sudžou, Kinija) ir patvirtinta DNR sekos nustatymu naudojant Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Kinija)..
Plazmidės be endotoksinų pcDNA3.1(+)-alpha-2 ir pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 buvo sukurtos naudojant SanPrep be endotoksinų Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).Koncentracija buvo palaikoma virš 500 ng/µl, siekiant užtikrinti, kad eliuavimo buferyje esantis EDTA netrukdytų transfekcijos tyrimui.Pirminiai pelių pilvaplėvės makrofagai buvo auginami 6 šulinėlių plokštelėse su visa RPMI 1640 terpe (Biological Industries) 12 valandų, po to ląstelės 3 kartus plaunamos šiltu PBS, kad būtų pašalintas penicilinas ir streptomicinas, o po to terpėje, papildytoje visa terpe.Endotoksinų neturinčios plazmidės pcDNA3.1(+)-alpha-2 ir pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 μg) buvo praskiestos 125 μl Opti-MEM sumažintos serumo terpės (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Tada 5 µl Lipofectamine 2000 transfekcijos reagento (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) buvo praskiesta 125 µl mažo serumo Opti-MEM terpės.Paruoškite liposomų-DNR kompleksus, sumaišydami praskiestą endotoksinų neturinčią plazmidę su Lipofectamine 2000 ir palikdami mišiniui kambario temperatūroje 5 minutes.Atskirai perkelkite kompleksus į kiekvieno šulinėlio ląsteles ir lėtai maišykite.Po 4 valandų ląstelių auginimo terpė buvo pakeista 2 ml pilnos RPMI 1640 terpės ir kultūra tęsiama 24 valandas.Į ląsteles buvo pridėta šviežia ląstelių auginimo terpė ir inkubuojama įvairiais laiko momentais, atsižvelgiant į tyrimo dizainą.
Baltymų mėginiai iš supernatantų ir ląstelių lizatų buvo paruošti, kaip aprašyta anksčiau [25].Pro-IL-1β, pro-kaspazės-1, kaspazės-1 p20, NLRP3, β-aktino ir His-tag membranos perdavimo parametrai buvo 200 mA/90 min.Interleukinui 1β (IL-1β; R&D Systems, Mineapolis, Minesota, JAV), kaspazei-1 (p20) (Adipogen, Šveicarija) ir NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Šveicarija) ir 1:5000, taikantis į His žymą ( Amylet Scientific Uhanas, Kinija) ir β-aktinas (Proteintech, Uhanas, Kinija).
Kryžminis ryšys su disukcinimido suberatu (DSS) buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau [26].Ląstelės 3 kartus plaunamos šaltu PBS ir visiškai lizuojamos 27 dydžio adata 50 µl ASC reakcijos buferyje (pH 8,0), kuriame yra 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES ir 125 mM NaHCO3.Mišinys centrifuguojamas 5000 g 3 min., o nuosėdos susiuvamos 10 µl DSS (25 mM DMSO) ir 40 µl ASC reakcijos buferio 30 min. 37 °C temperatūroje.Po centrifugavimo 5000 g 10 minučių, nuosėdos buvo ištirpintos 40 µl ASC reakcijos buferio ir 10 µl 6x baltymų įkrovimo buferio tirpale (TransGen, Pekinas, Kinija), o po to tirpalas gesinamas kambario temperatūroje 15 minučių. min., Tada virkite 10 minučių.Tada baltymų mėginiai buvo tiriami Western blot būdu, naudojant pirminius anti-ASC antikūnus (Wanleibio, Shenyang, Kinija), praskiedimo santykiu 1:500.
Pagal anksčiau aprašytą procedūrą [13], ląstelių kultūrų supernatantai buvo paimti ir priešuždegiminio citokino IL-1β sekrecija buvo nustatyta naudojant pelės IL-1 Beta ELISA rinkinį (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).OD450nm reikšmes konvertuokite į baltymų koncentracijas naudodami IL-1β standartinę kreivę.
Ląstelės, padengtos dengiamaisiais stikleliais, buvo švelniai plaunamos 3 kartus šiltu PBS, fiksuojamos audinių ląstelių fiksatoriuje (Biosharp, Pekinas, Kinija) 10 minučių kambario temperatūroje (RT), 0,1% Triton X-Permeabilize 100 °C temperatūroje (atskiestas PBS; Biosharp). ) 20 minučių kambario temperatūroje ir blokuoti 5% galvijų serumo albuminu (PBS) 2 valandas kambario temperatūroje.Tada ląstelės buvo inkubuojamos per naktį 4 °C temperatūroje su pirminiais antikūnais prieš ASC (1:100 praskiedimas) arba NLRP3 (1:100 praskiedimu) ir Cy3 pažymėtu ožkos anti-triušio IgG(H+L) (1:400; EarthOx). , San Franciskas, Kalifornija, JAV) arba FITC konjuguotas ožkos anti-pelės IgG (1:400; Earthox) per naktį 37 °C temperatūroje tamsoje 1 valandą.Branduoliai 5 minutes buvo nudažyti Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Sudžou, Kinija) ir stebimi fluorescenciniu mikroskopu (Olympus Corporation, Tokijas, Japonija).
Pelės buvo suskirstytos į keturias grupes (n = 7 kiekvienoje grupėje): (i) PBS gydyta neigiama kontrolinė grupė (tik PBS; zondu 100 µl/pelei PBS, o po 3 valandų kasdien švirkščiama į pilvaplėvės ertmę po 100 µl/pelei PBS)., nepertraukiamai 7 dienas);(ii) neigiama kontrolinė grupė, gydoma MCC950 inhibitoriumi [27] (100 µl/pelei per PBS zondą, po 3 valandų, 10 mg/kg kūno svorio [BW] MCC950 [PBS] buvo skiriama į pilvaplėvės ertmę kasdien, trukmė 7 dienos);(iii) G. duodenalis cistinės infekcijos grupė (1,5 x 106 cistos vienai pelei per zondą, po 3 valandų, 100 μl/pelei PBS intraperitoniniu būdu 7 dienas kasdien);(iv) G. duodenalis cistos kombinuotos infekcijos grupės MCC950 inhibitorių gydymo grupė (1,5 × 106 cistos vienai pelei per zondą, 10 mg/kg kūno svorio MCC950 intraperitoniniu būdu kasdien 7 dienas po 3 val.).Kiekvienos pelės kūno svoris buvo stebimas kasdien ir visos pelės buvo eutanazuotos 7 dieną.Nuimta dvylikapirštė žarna (3 cm ilgio) buvo supjaustyta mažais gabalėliais 1 ml PBS, cistos sunaikintos per naktį PBS 4 °C temperatūroje ir G. duodenalis trophozoites.Šviežia dvylikapirštės žarnos (1 cm ilgio) buvo išskirta hematoksilino ir eozino (H&E) dažymui.
Pelės buvo suskirstytos į dvi grupes: (i) MOCK kontrolinę grupę ir (ii) MCC950 inhibitorių grupę.Kiekvienoje grupėje buvo po penkis gydymo būdus (n = 7/gydymo grupėje): (i) PBS gydymo neigiama kontrolinė grupė (tik PBS; 100 µl/pelei PBS, injekcija į raumenis (IM) (blauzdikaulio priekinė dalis) [28, 29]; ii) pcDNA3.1(+) plazmidės neigiama kontrolinė grupė (100 µg/pelės DNR, injekcija į raumenis (iii) G. duodenalis cistos infekcijos teigiama kontrolinė grupė (1,5 x 106 cistos/pelė, per zondą) (iv) a); grupė, kuri buvo apdorota plazmide pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 μg/pelei DNR, švirkščiant į raumenis), ir (v) grupė, apdorota plazmide pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 µg/pelei). DNR, po 12 valandų pasėjimo, pelėms MCC950 inhibitorių grupėje kasdien buvo švirkščiama į pilvaplėvės ertmę MCC950 (10 mg/kg kūno svorio) 7 dienas, o pelėms MOCK grupėje buvo taikomas toks pat kiekis PBS. Buvo paimti kraujo mėginiai. surinkti iš akių obuolių pelių ir palikti per naktį 4 ° C temperatūroje. Serumo mėginiai buvo išskirti naudojant su fermentu susietą imunosorbento tyrimą (ELISA) ir matuojant IL-1β lygį.
Trisdešimt penkios pelės buvo suskirstytos į penkias grupes (n = 7 / grupė).1 grupė buvo neigiama kontrolinė grupė, gydoma PBS: pelėms buvo įšvirkščiama 100 μl PBS į raumenis ir po 3 dienų per zondą.2 grupė yra teigiama kontrolinė grupė, užsikrėtusi G. duodenalis cistomis: pelėms buvo sušvirkšta 100 μl PBS, o po 3 dienų 1,5 x 106 cistos vienai pelei į skrandį.Trečioji grupė – plazmidinė imunizacija su pcDNA3.1(+) kartu su kontroline dvylikapirštės žarnos cistos infekcijos grupe: pelėms buvo skirta 100 μg plazmidinės DNR pcDNA3.1(+)(im) per burną, 1,5×106 cistos/pelei 3 keletą kartų. dienų.4 ir 5 grupės buvo rekombinantinė pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardino plazmidė arba pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardino plazmidė kartu su G. duodenalis cistine infekcija.Eksperimentinė grupė: pelės gavo 100 µg pcDNA3.1 (+)-giardino plazmidės DNR (im), tada po 3 dienų per zondą buvo sušvirkšta 1, 5 × 106 cistos vienai pelei.Kiekvienos pelės kūno svoris buvo stebimas po to, kai per vamzdelį buvo įvesta G. duodenalis cista.Parazitinės apkrovos matavimams ir HE dažymo analizei buvo paimta šviežia dvylikapirštė žarna.
Histopatologiniai pokyčiai buvo analizuojami pagal anksčiau paskelbtą procedūrą [30].Šviežia dvylikapirštė žarna buvo fiksuota audinių ląstelių fiksatoriumi, įterpta į parafiną, supjaustyta į 4 μm pjūvius, nudažyta H&E ir analizuojama šviesos mikroskopu.Reprezentatyvius patologinius pokyčius septyniose septynių nepriklausomų pelių audinių dalyse įvertino patologas, nežinantis apie gydymą, ir jie buvo užfiksuoti 200 kartų padidinus.Gaurelių ilgis ir kriptų gylis buvo išmatuoti pagal anksčiau aprašytus metodus.
Rezultatai in vitro ir in vivo buvo gauti trimis egzemplioriais.Grafikai buvo sukurti naudojant GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, JAV).Dviejų grupių skirtumai buvo analizuojami t-testu, o skirtumai tarp ≥3 grupių buvo analizuojami naudojant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA), naudojant SPSS programinę įrangą (22.0 versija; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, JAV).Duomenys buvo analizuojami siekiant nustatyti dispersijos homogeniškumą, naudojant Levene testą, po to Bonferroni post hoc testą (B).Reikšmingumas išreiškiamas P<0,05, P<0,01 ir P<0,001 (nereikšmingas [ns]) (P>0,05).
Mūsų ankstesnė GEV proteomikos analizė Kioto genų ir genomų enciklopedijoje (KEGG) parodė, kad daugelis taikinių gali būti susiję su uždegiminių signalų perdavimo takų aktyvavimu [13].Mes pasirinkome du perspektyvius taikinius, alfa-2 ir alfa-7.3 giardinus, amplifikuojame šias molekules ir panaudojome jas pcDNA3.1(+) eukariotų ekspresijos vektoriaus konstravimui.Po sekos nustatymo rekombinantinės pcDNA3.1(+)-alfa-2 ir alfa-7.3 giardino ekspresijos plazmidės buvo transfekuotos į pirminius pelės pilvaplėvės makrofagus ir identifikuotas kaspazės-1 p20 uždegimo baltymas (aktyvintos kaspazės-1 fragmentas). kaip išsiaiškinti pagrindines molekules, kurios gali sukelti uždegimą.Rezultatai parodė, kad alfa-2 ir alfa-7.3 giardinai gali sukelti p20 kaspazės-1 ekspresiją, panašią į GEV.Neapdorota neigiama kontrolė (tik PBS) ir plazmidės kontrolė pcDNA3.1(+) nenustatyta jokio poveikio kaspazės-1 aktyvacijai (1 pav.).
P20 kaspazės-1 aktyvacijos matavimas naudojant pcDNA3.1(+)-alfa-2 ir alfa-7.3 giardinus.Rekombinantinės eukariotinės ekspresijos plazmidės pcDNA3.1(+)-alfa-2 ir alfa-7.3 giardinai (virš kiekvienos juostos) buvo transfekuotos į pirminius pelės pilvaplėvės makrofagus, o kultūros supernatantai buvo surinkti po 24 valandų.Western blot buvo naudojamas kaspazės-1 p20 uždegiminio baltymo ekspresijos lygiams matuoti.Tik PBS gydymo grupė (C juosta) ir pcDNA3.1(+) monoterapijos grupė (pcDNA3.1 juosta) buvo naudojamos kaip neigiama kontrolė, o GEV gydymo grupė buvo naudojama kaip teigiama kontrolė.Rekombinantinio baltymo ekspresija buvo patvirtinta kiekviename baltyme aptikus histidino žymę, o numatomos baltymų juostos buvo alfa-2 giardinas (38,2 kDa) ir alfa-7,3 giardinas (37,2 kDa).GEV, Giardia dvylikapirštės žarnos ekstraląstelinės pūslelės, pcDNA3.1(+), EcoRV linijinis vektorius, SUP, supernatantas
Norint nustatyti, ar alfa-2 giardinas ir alfa-7.3 giardinas sukelia p20 kaspazės-1 ekspresiją ir vaidina svarbų vaidmenį aktyvuojant šeimininko NLRP3 uždegiminį atsaką, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinas ir pcDNA3.1(+)-alfa -7,3 giardinas buvo transfekuotas į pirminius pelių pilvaplėvės makrofagus su rekombinantine plazmidine DNR ir nustatyti pagrindinių uždegiminių baltymų NLRP3 ekspresijos, lokalizacijos ir oligomerizacijos lygiai.Šiame eksperimente GEV buvo naudojama kaip teigiama kontrolinė grupė, o negydoma (tik PBS) arba pcDNA3.1(+) transfekcija buvo neigiama grupė.Rezultatai parodė, kad, kaip ir GEV grupėje, giardino pcDNA3.1(+)-alfa-2 ir giardino pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 rekombinantinė plazmidinė DNR padidino NLRP3, pro-IL-1β ir prokaspazės-1 ir kaspazės-1 aktyvacija (2a pav.).Be to, abi giardinos sukėlė reikšmingą IL-1β sekreciją (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardinas: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3 giardinas: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (2b pav.).Dauguma ASC baltymų buvo monomeriniai negydomoje grupėje arba gydymo grupėje, kuri buvo transfekuota pcDNA3.1(+) plazmide, priešingai nei pcDNA3.1(+)-alfa-2 arba pcDNA3.1(+)-alfa- 7.3 giardina.ASC oligomerizacija įvyko GEV teigiamos kontrolinės grupės ar grupės rekombinantinėje plazmidinėje DNR, rodančioje oligomerinę formą (2c pav.).Šie preliminarūs duomenys rodo, kad alfa-2 giardinas ir alfa-7, 3 giardinas gali sukelti NLRP3 uždegimo aktyvavimą.Vėlesni imunofluorescenciniai ASC ir NLRP3 lokalizacijos tyrimai parodė, kad neigiamoje kontrolinėje grupėje ASC baltymas buvo išsklaidytas po citoplazmą ir, stimuliuojant pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinu arba pcDNA3, pasirodė kaip taškinis signalas.1(+)-alfa-7,3 giardino grupė arba GEV teigiama kontrolinė grupė (2d pav.).Neigiamos kontrolės ir plazmidėmis apdorotose pcDNA 3.1 grupėse NLRP3 baltymo signalas nebuvo aptiktas, o fluorescencinio signalo taškas, reaguojant į pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardiną arba pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 buvo aptiktas..giardino randama citoplazmoje arba stimuliuojant HEV (2e pav.).Šie duomenys taip pat rodo, kad G. duodenalis giardin alfa-2 ir giardin alfa-7.3 aktyvuoja NLRP3 uždegimą pelių pirminiuose pilvaplėvės makrofaguose.
pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinas ir pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardinas suaktyvina NLRP3 uždegimą pelių pilvaplėvės makrofaguose.Transfekuokite rekombinantines eukariotų ekspresijos plazmides pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin ir pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin į pirminius pelių pilvaplėvės makrofagus ir ląsteles arba surinkite supernatantą per 24 valandas, kad galėtumėte analizuoti ekspresiją, oligomerizaciją. , sekretas.ir pagrindinių uždegiminių baltymų lokalizacija.Tik PBS (C) grupė ir pcDNA3.1(+) vieno gydymo grupė buvo naudojamos kaip neigiama kontrolė, o GEV gydymo grupė buvo naudojama kaip teigiama grupė.Pagrindiniai uždegiminiai baltymai NLRP3, įskaitant NLRP3, pro-IL-1β, pro-kaspazę-1 ir p20 kaspazę-1, buvo aptikti Western blot metodu.b IL-1β sekrecijos lygiai supernatantuose buvo nustatyti naudojant su fermentu susietą imunosorbentinį tyrimą (ELISA).Skirtumai tarp kontrolinių ir eksperimentinių grupių buvo analizuojami taikant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA), naudojant SPSS programinės įrangos 22.0 versiją.Žvaigždutės žymi reikšmingus skirtumus tarp grupių **P<0,01 ir ***P<0,001.c ASC oligomerizacijos lygiai granulėse buvo nustatyti naudojant DSS kryžminio ryšio analizę, o ASC lygiai ląstelių lizatuose buvo naudojami kaip pakrovimo kontrolė.d ISC lokalizacijos vizualizavimas naudojant imunofluorescenciją.NLRP3 lokalizacijai vizualizuoti buvo naudojama imunofluorescencija.ASC, į apoptotinį taškelį panašus baltymas;IL, interleukinas;NLRP3, nukleotidus surišantis į oligomerizaciją panašus receptorius 3;ns, nereikšminga (P > 0,05)
Tiek G. duodenalis, tiek jo išskiriami GEV aktyvina NLRP3 uždegimą ir reguliuoja šeimininko uždegiminius atsakus in vitro.Taigi, NLRP3 uždegimo vaidmuo G. duodenalis patogeniškume lieka neaiškus.Norėdami ištirti šią problemą, sukūrėme eksperimentą tarp pelių, užsikrėtusių G. duodenalis cista, ir pelių, užsikrėtusių G. duodenalis cista + MCC950 inhibitoriumi, ir palyginome NLRP3 uždegiminę raišką, kai buvo užsikrėtę G. duodenalis cista.Išsami eksperimento schema parodyta 3a pav.Pelių kūno svorio pokyčiai skirtingose ​​gydymo grupėse buvo stebimi 7 dienas po užsikrėtimo cistomis, o rezultatai parodyti 3b pav.Palyginti su grupe, gydyta grynu PBS, rezultatai parodė, kad (i) pelių, užsikrėtusių G. duodenalis cista, kūno svoris sumažėjo nuo 3 dienos iki 7 dienos po užsikrėtimo;(ii) gydymas MCC950 inhibitoriumi neturėjo reikšmingo poveikio pelių kūno svoriui..Palyginti su vienos infekcijos grupe, dvylikapirštės žarnos infekcijos grupės, gydytos MCC950, kūno masė sumažėjo įvairiais laipsniais (1 diena: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; 2 diena: ANOVA, F( 3, 24). ) = 0,4602, P<0,0001 3 diena: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052, FANO: ; (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645; 6 diena: ANOVA, F(3, 24) = 5,457, P = 0,0175: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Šie duomenys rodo, kad NLRP3 uždegimas apsaugo peles nuo didelio svorio netekimo ankstyvose dvylikapirštės žarnos infekcijos stadijose (2–4 dienos).Tada siekėme aptikti G. duodenalis trofozoitus dvylikapirštės žarnos plovimo skystyje, o rezultatai parodyti 3c paveiksle.Lyginant su G. duodenalis cistinės infekcijos grupe, dvylikapirštėje žarnoje trofozoitų skaičius reikšmingai padidėjo blokavus NLRP3 uždegimą (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Dvylikapirštės žarnos audiniai, nudažyti HE, parodė, lyginant su neigiama kontrole, gydyta vien PBS ir MCC950: (i) G. duodenalis cistos infekcija sukėlė dvylikapirštės žarnos gaurelių pažeidimą (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0488 ) ir kriptų atrofija (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) G. duodenalis cistomis užkrėstų ir MCC950 inhibitoriais gydomų pelių dvylikapirštės žarnos.dvylikapirštės žarnos gaureliai buvo pažeisti ir negyvi (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) su atrofija ir kriptos šakojimu (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (3d pav. f) .Šie rezultatai rodo, kad NLRP3 uždegimas atlieka svarbų vaidmenį mažinant G. duodenalis patogeniškumą.
NLRP3 uždegimo vaidmuo sergant Giardia dvylikapirštės žarnos infekcija.Pelės buvo zonduojamos (iv) duodenokokinėmis cistomis, o po to buvo gydomos MCC950 arba be jo (ip).Kaip kontrolė buvo naudojamos atskiros gydymo grupės su PBS arba MCC950.Eksperimentinė grupė ir gydymo režimas.b Pelių kūno svoris kiekvienoje iš įvairių gydymo grupių buvo stebimas 7 dienas.Skirtumas tarp G. duodenalis infekcijos grupės ir G. duodenalis + MCC950 infekcijos gydymo grupės buvo analizuojamas t-testu naudojant SPSS programinės įrangos versiją 22.0.Žvaigždutės žymi reikšmingus skirtumus, kai *P<0,05, **P<0,01 arba ***P<0,001.c Parazitinė apkrova buvo nustatyta skaičiuojant trofozoitų skaičių dvylikapirštės žarnos plovimo skystyje.Skirtumas tarp G. duodenalis infekcijos grupės ir G. duodenalis + MCC950 infekcijos gydymo grupės buvo analizuojamas t-testu naudojant SPSS programinės įrangos versiją 22.0.Žvaigždutės žymi reikšmingus skirtumus, kai *P < 0,05.d Dvylikapirštės žarnos histopatologijos dažymo hematoksilinu ir eozinu (H&E) rezultatai.Raudonos rodyklės rodo gaurelių pažeidimus, žalios – kriptų pažeidimus.Mastelio juosta: 100 µm.e, f Dvylikapirštės žarnos gaurelių aukščio ir pelės kriptos aukščio statistinė analizė.Žvaigždutės žymi reikšmingus skirtumus, kai *P<0,05 ir **P<0,01.Rezultatai paimti iš 7 nepriklausomų biologinių eksperimentų.BW, kūno svoris;ig, intragastrinis pristatymo būdas;ip, intraperitoninis pristatymo būdas;ns, nereikšmingas (P > 0,05);PBS, fosfatiniu buferiniu tirpalu;WT, laukinis tipas
IL-1β sekrecija yra uždegimo aktyvinimo požymis.Norėdami nustatyti, ar G. duodenalis alfa-2 giardinas ir alfa-7.3 giardinas suaktyvina NLRP3 šeimininko uždegimą in vivo, naudojome neapdorotas WT peles (fiktyvi grupė) ir NLRP3 uždegimo blokuotas peles (MCC950 slopinama gydymo grupė).Išsami eksperimento schema parodyta 4a pav.Eksperimentines grupes sudarė pelės, gydytos PBS, G. duodenalis cistos gydytos zondu, pcDNA3.1 injekcija į raumenis ir pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardino arba pcDNA3.1-alfa-7.3 giardino injekcija į raumenis.7-ą dieną po rekombinantinės plazmidės įvedimo į raumenis buvo surinktas serumas ir kiekvienoje grupėje nustatytas IL-1β lygis.Kaip parodyta 4b paveiksle, MOCK grupėje: (i) lyginant su PBS grupe, gydymas pcDNA3.1 neturėjo reikšmingo poveikio IL-1β sekrecijai (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), tačiau IL-β sekrecija buvo reikšmingai padidėjusi G. duodenalis cistų grupėje (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2 giardine ir pcDNA3.1- Alfa-7,3 giardino injekcija į raumenis reikšmingai padidino IL-1β koncentraciją serume (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardinas sukėlė didelį IL-1β sekreciją pcDNA3.1-alfa-2 giardino injekcijos į raumenis grupėje (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .Palyginti su kiekviena grupe gydymo MCC950 grupėje ir MOCK grupėje: (i) IL-1β sekrecijos lygis PBS kontrolinėje grupėje ir pcDNA3.1 kontrolinėje grupėje po MCC950 inhibitoriaus blokavimo tam tikru mastu sumažėjo, tačiau skirtumas nebuvo toks. reikšmingas (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3,1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) užblokavus MCC950., IL-1β sekrecija reikšmingai sumažėjo G. duodenalis cista infekuotų grupėje, pcDNA3.1-alfa-2 giardino grupėje ir pcDNA3.1-alfa-7.3 giardino grupėje (G. duodenalis: ANOVA, F(9). , 58) = 3,540, P = 0,0120 pcDNA3,1-alfa-2 giardinas: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447 pcDNA3,1-alfa-7,3 giardinas (9, ANOVA5, 8); ) = 3,540, P = 0,0164).Šie rezultatai rodo, kad alfa-2 giardinas ir alfa-7.3 giardinas tarpininkauja aktyvinant NLRP3 uždegimą in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardinos suaktyvina NLRP3 šeimininko uždegiminę in vivo.Pelės buvo imunizuotos (IM) rekombinantine eukariotų ekspresijos plazmide pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine arba pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine, o po to buvo apdorotos MCC950 (ip; MCC950 grupė) arba ne (fiktyvi grupė). ).PBS arba pcDNA3.1(+) plazmidės gydymo grupė buvo naudojama kaip neigiama kontrolė, G. duodenalis cistos gydymo grupė buvo naudojama kaip teigiama kontrolė.Eksperimentinė grupė ir gydymo režimas.b IL-1β kiekis pelių serume buvo išmatuotas 7 dieną ELISA tyrimu.MOCK grupės grupių skirtumai buvo analizuojami naudojant vienpusę ANOVA, o skirtumai tarp MOCK grupės ir MCC950 grupės buvo analizuojami naudojant SPSS programinės įrangos 22.0 versijos t-testą.Žvaigždutės rodo reikšmingus skirtumus tarp gydymo grupių MOCK grupėje, *P<0,05 ir ***P<0,001;dolerio ženklai ($) rodo reikšmingus skirtumus tarp kiekvienos grupės MOCK ir MCC950 grupėje, kai P<0,05.Septynių nepriklausomų biologinių eksperimentų rezultatai.i, injekcija į raumenis, ns, nereikšminga (P > 0,05)
Norėdami ištirti alfa-2 ir alfa-7.3 giardino sukeltos NLRP3 šeimininko uždegimo aktyvacijos poveikį G. duodenalis užkrečiamumui, naudojome WT C57BL/6 peles ir suleidome alfa-2 giardiną ir alfa-7.3 giardiną.plazmidė buvo suleista į raumenis, po 3 dienų per G. duodenalis cistos skrandžio vamzdelį, po to pelės buvo stebimos 7 dienas.Išsami eksperimento schema parodyta 5a pav.Kiekvieną dieną buvo matuojamas kiekvienos pelės kūno svoris, 7 dieną po įvedimo per skrandžio zondą buvo paimti šviežio dvylikapirštės žarnos audinio mėginiai, matuojamas trofozoitų skaičius ir stebimi histopatologiniai pokyčiai.Kaip parodyta 5b paveiksle, ilgėjant maitinimo laikui, kiekvienos grupės pelių kūno masė palaipsniui didėjo.Pelių MT pradėjo mažėti 3 dieną po G. duodenalis cistų skyrimo į skrandį, o vėliau palaipsniui didėjo.NLRP3 uždegimo suaktyvinimas, sukeltas į raumenis alfa-2 giardino ir alfa7.3 giardino injekcijos, reikšmingai sumažino pelių svorio netekimą (1 diena: pcDNA3.1-alfa-2 giardinas, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 1 diena: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardinas, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9987 2 diena: pcDNA3.1-alfa-2 giardinas, ANOVA, F( 4, 30) = 0,3172, P = 0,9979 2 diena: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardinas, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409 3 diena: pcDNA3.1-alfa-2 ANOVA, F,; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 3 diena: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardinas, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083 4 diena: pcDNA3.1-alfa-2VA giardinas; , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, 4 diena: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardinas, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, 5 diena: pcDNA3,1-alpha 2 giardinas, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 5 diena: pcDNA3,1-alfa -7,3 giardinas, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 6 diena: .1 -DNA alfa-2 giardinas, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, 6 diena: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardinas, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;7 diena: pcDNA3.1-alfa-2 giardinas, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 7 diena: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardinas, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Parazitinė apkrova buvo įvertinta dvylikapirštėje žarnoje (5c pav.).Palyginti su negydyta teigiama kontrole ir grupe, kuriai buvo sušvirkštas tuščias pcDNA3.1 vektorius, G. duodenalis trofozoitų skaičius reikšmingai sumažėjo grupėse, kurioms buvo sušvirkštas α-2 giardinas ir α-7,3 giardinas (pcDNA3.1-alfa). -2 giardinas : ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3,1-alfa-7,3 giardinas: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Be to, giardinas alfa-7,3 labiau apsaugojo peles nei giardinas alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).HE dažymo rezultatai parodyti fig.5d–f.Pelėms, kurioms buvo sušvirkštas alfa-2 giardinas ir alfa-7.3 giardinas, buvo mažiau dvylikapirštės žarnos audinių pažeidimų, pasireiškusių gaurelių pažeidimu, palyginti su pelėmis, kurioms buvo suleista G. duodenalis, ir pelėmis, kurioms buvo suleista G. duodenalis kartu su tuščiu pcDNA3 vektoriumi .1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2 giardinas: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 arba P = 0,0068; pcDNA3.1-alfa-7,3 giardinas: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 arba P = 0,0055) ir sumažinta kriptos atrofija (pcDNA3.1-alfa-2 giardinas: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 arba P = 0,0158; pcDNA3.1-alfa-7,3 ANOVAgiardinas , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 arba P = 0,0191).Šie rezultatai rodo, kad alfa-2 giardinas ir alfa-7,3 giardinas sumažina G. duodenalis užkrečiamumą, aktyvindami NLRP3 uždegimą in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardinų vaidmuo sergant G. duodenalis infekcija.Pelės buvo imunizuotos (IM) rekombinantinėmis eukariotų ekspresijos plazmidėmis pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine arba pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine, o po to užkrėstos G. duodenalis cistomis (ig).PBS grupė ir pcDNA3.1(+) + dvylikapirštės žarnos cistos gydymo grupė buvo naudojamos kaip neigiamos kontrolinės grupės, o dvylikapirštės žarnos cistos gydymo grupė buvo naudojama kaip teigiama kontrolinė grupė.Eksperimentinė grupė ir gydymo režimas.b Pelių MT kiekvienoje iš įvairių gydymo grupių buvo stebimas 7 dienas po užkrėtimo.Žvaigždutės rodo reikšmingus skirtumus tarp G. duodenalis grupės ir pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardino grupės grupių, *P < 0,05, **P < 0,01 ir ***P < 0,001;dolerio ženklas ($) rodo reikšmingą skirtumą tarp kiekvienos G. duodenalis grupės ir pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine grupės, $$P<0.01 ir $$$P<0.001.c Parazitinė apkrova buvo nustatyta skaičiuojant trofozoitų skaičių 1 ml dvylikapirštės žarnos plovimo (3 cm ilgio) ir išreikšta parazitų skaičiumi dvylikapirštės žarnos cm.Skirtumai tarp G. duodenalis infekcijos grupės, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinų grupės ir pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardinų grupės buvo išanalizuoti taikant vienpusę ANOVA, naudojant SPSS programinės įrangos 22.0 versiją.Žvaigždutės žymi reikšmingus skirtumus, kai **P<0,01 ir ***P<0,001.d Histopatologiniai pokyčiai dvylikapirštėje žarnoje.Raudonos rodyklės rodo gaurelių pažeidimus, žalios – kriptų pažeidimus.Mastelio juosta: 100 µm.e, f Pelės dvylikapirštės žarnos gaurelių aukščio (e) ir kriptos aukščio (f) statistinė analizė.Skirtumai tarp grupių 1d paveiksle buvo išanalizuoti naudojant vienpusę ANOVA, naudojant SPSS programinės įrangos versiją 22.0.Žvaigždutės žymi reikšmingus skirtumus, kai *P<0,05 ir **P<0,01.Septynių nepriklausomų biologinių eksperimentų rezultatai.ns, nereikšminga (P > 0,05)
Dvylikapirštės žarnos žiardija yra gerai žinomas žmonių ir kitų žinduolių žarnyno parazitas, sukeliantis giardiazę.2004 m. jis buvo įtrauktas į PSO užleistų ligų iniciatyvą dėl didelio paplitimo per 6 metus, ypač žemos socialinės ir ekonominės padėties bendruomenėse [32].Įgimta imuninė sistema atlieka svarbų vaidmenį imuniniame atsake į G. duodenalis infekciją.Buvo pranešta, kad pelių makrofagai, išleisdami tarpląstelinius spąstus, praryja ir nužudo G. duodenalis [33].Mūsų ankstesni tyrimai parodė, kad G. duodenalis, neinvazinis tarpląstelinis parazitas, aktyvina p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 ir NLRP3 uždegiminius signalizacijos kelius pelių makrofaguose, kad reguliuotų šeimininko uždegiminius atsakus, o išleistas GEV gali sustiprinti šį procesą.13], 24].Tačiau tikslūs PAMP, susiję su NLRP3 uždegimo reguliuojamu uždegimu GEV, ir NLRP3 uždegimo vaidmenį sergant giardiaze, dar reikia išsiaiškinti.Norėdami išsiaiškinti šiuos du klausimus, atlikome šį tyrimą.
NLRP3 uždegimas yra imuninių ląstelių citoplazmoje ir gali būti aktyvuotas įvairių dalelių, tokių kaip šlapimo rūgšties kristalai, toksinai, bakterijos, virusai ir parazitai.Atliekant bakterijų tyrimus, toksinai buvo nustatyti kaip pagrindiniai PAMP, kurie aktyvuoja uždegiminius jutiklius ir sukelia uždegimą ir ląstelių mirtį [34].Kai kurie struktūriškai įvairūs toksinai, tokie kaip hemolizinas iš Staphylococcus aureus [35] ir Escherichia coli [36], hemolizinas BL (HBL) iš enterotoksino (NHE) [37], skatina NLRP3 uždegimo aktyvavimą.Virusiniai tyrimai parodė, kad virulentiškumo baltymai, tokie kaip SARS-COV-2 apvalkalo (E) baltymas [38] ir Zikos viruso NS5 baltymas [39], yra svarbūs PAMP, kuriuos atpažįsta NLRP3 receptorius.Parazitų tyrimų metu buvo pranešta, kad daugelis parazitų yra susiję su šeimininko uždegiminiu aktyvavimu, pvz., Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] ir Leishmania [42].Tankūs granulių baltymai GRA35, GRA42 ir GRA43, susiję su Toxoplasma gondii virulentiškumu, reikalingi piroptozei sukelti Lewis žiurkių makrofaguose [43].Be to, kai kuriuose Leishmania tyrimuose pagrindinis dėmesys buvo skiriamas atskiroms molekulėms, susijusioms su NLRP3 uždegimu, tokiomis kaip parazitinės membranos lipofosfoglikanas [44] arba cinko metaloproteazė [45].Įrodyta, kad tarp aneksino tipo alfa-giardino genų šeimos alfa-1 giardinas yra potencialus vakcinos kandidatas, suteikiantis apsaugą nuo G. duodenalis pelių modelyje [18].Savo tyrime pasirinkome G. duodenalis virulentiškumo faktorius alfa-2 ir alfa-7,3 giardines, kurios būdingos tik giardijai, tačiau apie jas pranešama santykinai mažiau.Šie du tiksliniai genai buvo klonuoti į pcDNA3.1(+) eukariotinės ekspresijos sistemos vektorių uždegimo aktyvacijos analizei.
Mūsų pelės modelyje suskaidyti kaspazės fragmentai yra uždegiminio aktyvavimo žymenys.Po stimuliacijos NLRP3 sąveikauja su ASC, įdarbina procaspazes ir generuoja aktyvias kaspazes, kurios suskaido pro-IL-1β ir pro-IL-18 į subrendusią IL-1β ir IL-18, atitinkamai -18.Uždegiminės kaspazės (kaspazės-1, -4, -5 ir -11) yra konservuota cisteino proteazių šeima, kuri yra labai svarbi įgimtai gynybai ir yra susijusi su uždegimu bei užprogramuota ląstelių mirtimi [46].Kaspazę-1 suaktyvina kanoniniai uždegimai [47], o kaspazės-4, -5 ir -11 suskaidomos formuojantis netipiniams uždegimams [48].Šiame tyrime kaip modelį naudojome pelių pilvaplėvės makrofagus ir ištyrėme p20 kaspazės-1 suskaldytą kaspazę-1 kaip šeimininko NLRP3 uždegimo aktyvacijos žymeklį G. duodenalis infekcijos tyrimuose.Rezultatai parodė, kad daugelis alfa-giardinų yra atsakingi už tipišką uždegimo aktyvavimą, o tai atitinka pagrindinių virulentiškumo molekulių, susijusių su bakterijomis ir virusais, atradimą.Tačiau mūsų tyrimas yra tik preliminarus patikrinimas ir yra ir kitų molekulių, kurios gali suaktyvinti neklasikinius uždegimus, nes ankstesniame tyrime G. duodenalis infekcijoje buvo nustatyti tiek klasikiniai, tiek neklasikiniai uždegimai [13].Norėdami toliau nustatyti, ar sukurta p20 kaspazė-1 yra susijusi su NLRP3 uždegimu, mes transfekavome alfa-2 ir alfa-7.3 giardinus į pelių pilvaplėvės makrofagus, kad nustatytume pagrindinius molekulių baltymų ekspresijos lygius ir ASC oligomerizacijos lygius, patvirtinančius, kad abu α-giardinai aktyvuojasi. uždegiminis NLRP3.Mūsų rezultatai šiek tiek skiriasi nuo Manko-Prykhoda ir kt., kurie pranešė, kad Caco-2 ląstelių stimuliavimas vien G. muris arba E. coli EPEC padermėmis gali padidinti NLRP3, ASC ir kaspazės-1 fluorescencijos intensyvumą. nors ir nežymiai, tačiau kaip G. muris ir E. coli kostimuliacija padidino trijų baltymų kiekį [49].Šis neatitikimas gali atsirasti dėl Giardia rūšių, ląstelių linijų ir pirminių ląstelių pasirinkimo skirtumų.Taip pat atlikome in vivo tyrimus naudodami MCC950 su 5 savaičių amžiaus WT C57BL/6 pelių patelėmis, kurios yra jautresnės G. duodenalis.MCC950 yra stiprus ir selektyvus mažos molekulės NLRP3 inhibitorius, blokuojantis kanoninį ir nekanoninį NLRP3 aktyvavimą esant nanomolinėms koncentracijoms.MCC950 slopina NLRP3 aktyvaciją, bet neturi įtakos AIM2, NLRC4 ir NLRP1 uždegiminių takų ar TLR signalizacijos takų aktyvavimui [27].MCC950 blokuoja NLRP3 aktyvaciją, bet neslopina NLRP3 iniciacijos, K+ ištekėjimo, Ca2+ antplūdžio ar NLRP3 ir ASC sąveikos;vietoj to jis slopina NLRP3 uždegiminį aktyvavimą blokuodamas ASC oligomerizaciją [27].Todėl in vivo tyrime naudojome MCC950, norėdami nustatyti NLRP3 uždegimo vaidmenį po giardino injekcijos.Aktyvuota kaspazė-1 p10 suskaldo priešuždegiminius citokinus pro-IL-1β ir pro-IL-18 į subrendusius IL-1β ir IL-18 [50].Šiame tyrime IL-1β koncentracija serume giardine gydytose pelėse su MCC950 arba be jos buvo naudojama kaip indikatorius, rodantis, ar NLRP3 uždegimas buvo suaktyvintas.Kaip ir tikėtasi, gydymas MCC950 žymiai sumažino IL-1β kiekį serume.Šie duomenys aiškiai rodo, kad G. duodenalis giardinas alfa-2 ir giardinas alfa-7.3 gali suaktyvinti NLRP3 pelės uždegimą.
Per pastarąjį dešimtmetį sukaupti reikšmingi duomenys parodė, kad IL-17A yra pagrindinis imuniteto prieš G. muris reguliatorius, skatinantis IL-17RA signalizaciją, gaminantis antimikrobinius peptidus ir reguliuojantis komplemento aktyvaciją [51].Tačiau Giardia infekcija dažniau pasireiškia jauniems suaugusiems žmonėms, ir buvo pranešta, kad Giardia infekcija jaunoms pelėms nesuaktyvina IL-17A atsako, kad veiktų apsauginis poveikis [52], todėl mokslininkai ieško kitų imunomoduliuojančių Giardia.helminto infekcijos mechanizmai.Neseniai atlikto tyrimo autoriai pranešė, kad G. muris gali suaktyvinti E. coli EPEC sukeliamą NLRP3 uždegimą, kuris skatina antimikrobinių peptidų gamybą ir mažina jo prisitvirtinimo gebą bei trofozoitų skaičių žarnyno trakte, taip sumažindamas storosios žarnos sunkumą. bacilų sukeltos ligos [49].NLRP3 uždegimas yra susijęs su įvairių ligų vystymusi.Tyrimai parodė, kad Pseudomonas aeruginosa sukelia autofagiją makrofaguose, kad būtų išvengta ląstelių mirties, ir šis procesas priklauso nuo NLRP3 uždegimo aktyvacijos [53].N. caninum reaktyviųjų deguonies rūšių sukeltas NLRP3 uždegimo aktyvavimas riboja jos replikaciją šeimininke, todėl tai gali būti terapinis taikinys [9].Nustatyta, kad Paracoccidioides brasiliensis sukelia NLRP3 uždegimo aktyvavimą pelių kaulų čiulpų kilmės dendritinėse ląstelėse, todėl išsiskiria uždegiminis citokinas IL-1β, kuris vaidina lemiamą vaidmenį šeimininko gynyboje [10].Kelios Leishmania rūšys, įskaitant L. amazonensis, L. major, L. braziliensis ir L. infantum chagasi, aktyvina NLRP3 ir nuo ASC priklausomą kaspazę-1 makrofaguose, taip pat Leishmania infekciją.Parazitų replikacija sustiprėja pelėms, kurioms trūksta NLRP3/ASC/kaspazės-1 geno [11].Zamboni ir kt.Buvo pranešta, kad Leishmania infekcija makrofaguose suaktyvina NLRP3 uždegimą, o tai riboja tarpląstelinių parazitų replikaciją.Taigi, Leishmania gali slopinti NLRP3 aktyvaciją kaip vengimo strategiją.In vivo tyrimuose NLRP3 uždegimas prisidėjo prie leišmanijos pašalinimo, bet nepaveikė audinių [54].Ir atvirkščiai, helmintozės tyrimuose NLRP3 uždegimo aktyvinimas slopino apsauginį šeimininko imunitetą nuo virškinimo trakto helmintozės [12].Shigella yra viena iš pagrindinių bakterijų, sukeliančių viduriavimą visame pasaulyje.Šios bakterijos gali sukelti IL-1β gamybą per P2X7 receptorių sukeltą K+ išsiliejimą, reaktyviąsias deguonies rūšis, lizosomų rūgštėjimą ir mitochondrijų pažeidimus.NLRP3 uždegimas neigiamai reguliuoja fagocitozę ir makrofagų baktericidinį aktyvumą prieš Shigella [55].Plasmodium tyrimai parodė, kad AIM2, NLRP3 arba kaspazės-1 stokojančios pelės, užsikrėtusios Plasmodium, gamina daug 1 tipo interferono ir yra atsparesnės Plasmodium infekcijai [56].Tačiau alfa-2 giardino ir alfa-7.3 giardino vaidmuo skatinant patogeninį NLRP3 uždegimo aktyvavimą pelėms yra neaiškus.
Šiame tyrime NLRP3 uždegimo slopinimas MCC950 sumažino KW ir padidino trofozoitų skaičių pelių žarnyno plovimo skystyje, todėl atsirado sunkesnių patologinių pokyčių dvylikapirštės žarnos audinyje.Alfa-2 giardinas ir alfa-7.3 giardinas suaktyvina pelės šeimininkės NLRP3 uždegimą, padidina pelės kūno svorį, sumažina trofozoitų skaičių žarnyno plovimo skystyje ir palengvina patologinius dvylikapirštės žarnos pažeidimus.Šie rezultatai rodo, kad G. duodenalis gali suaktyvinti NLRP3 šeimininko uždegimą per alfa-2 giardiną ir alfa-7,3 giardiną, sumažindamas G. duodenalis patogeniškumą pelėms.
Bendrai, mūsų rezultatai rodo, kad alfa-2 ir alfa-7.3 giardinos skatina NLRP3 šeimininko uždegimo aktyvavimą ir sumažina G. duodenalis užkrečiamumą pelėms.Todėl šios molekulės yra perspektyvūs giardiazės prevencijos tikslai.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiazė: apžvalga.Neseniai paaiškėjo, kad Pat Inflamm yra alergiškas vaistams.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: farmakoterapijos apžvalga.Vaistininko specialisto nuomonė.2007 m.;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiazė, atsparumas vaistams ir naujų taikinių atradimas.Užkrečia Disord narkotikų taikinius.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T ir kt. NLRP3 uždegiminės ir uždegiminės ligos.Oxide Med Cell Longev.2020; 2020: 4063562.
Chen GY, Núñez G. Uždegimo vaidmuo sergant žarnyno uždegimu ir vėžiu.Gastroenterologija.2011 m.;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kanoninis ir netipinis NLRP3 uždegiminis aktyvavimas imuninės tolerancijos ir žarnyno uždegimo kryžkelėje.priešimuninis.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S ir kt.ROS sukelta NLRP3 uždegiminė aktyvacija yra susijusi su atsaku į N. caninum infekciją.Parazitų vektorius.2020; 13:449.