Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą.Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Tuo tarpu norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę pateiksime be stilių ir „JavaScript“.
Toxoplasma gondii yra tarpląstelinis pirmuonis parazitas, kuris moduliuoja užkrėsto šeimininko mikroaplinką ir, kaip žinoma, yra susijęs su smegenų auglio augimo dažniu.Šiame tyrime iškeliame hipotezę, kad egzosominė miRNR-21 nuo Toxoplasma infekcijos skatina smegenų auglio augimą.Buvo apibūdintos toksoplazma užkrėstų BV2 mikroglijų egzosomos ir patvirtinta U87 gliomos ląstelių internalizacija.Egzosominės mikroRNR ekspresijos profiliai buvo analizuojami naudojant mikroRNR ir mikroRNR-21A-5p matricas, susijusias su Toxoplasma gondii ir naviko rūšiavimu.Mes taip pat ištyrėme su naviku susijusių genų mRNR lygį U87 gliomos ląstelėse, keisdami miR-21 lygius egzosomose ir egzosomų poveikį žmogaus U87 gliomos ląstelių proliferacijai.U87 gliomos ląstelių, užkrėstų Toxoplasma gondii, egzosomose padidėja mikroRNR-21 ekspresija ir sumažėja priešnavikinių genų (FoxO1, PTEN ir PDCD4) aktyvumas.Iš BV2 gautos egzosomos, užkrėstos Toxoplasma, sukelia U87 gliomos ląstelių proliferaciją.Egzosomos skatina U87 ląstelių augimą pelės naviko modelyje.Siūlome, kad padidėjęs egzosominis miR-21 toksoplazma užkrėstose BV2 mikroglijose gali atlikti svarbų vaidmenį kaip ląstelių augimo stimuliatorius U87 gliomos ląstelėse, sumažindamas priešnavikinius genus.
Apskaičiuota, kad 2018 m. visame pasaulyje buvo diagnozuota daugiau nei 18,1 milijono pažengusio vėžio atvejų, kasmet diagnozuojama apie 297 000 centrinės nervų sistemos navikų (1,6 % visų navikų)1.Ankstesni tyrimai parodė, kad žmogaus smegenų auglių išsivystymo rizikos veiksniai yra įvairūs cheminiai produktai, šeimos istorija ir galvos terapinės bei diagnostinės įrangos jonizuojanti spinduliuotė.Tačiau tiksli šių piktybinių navikų priežastis nežinoma.Maždaug 20 % visų vėžio atvejų visame pasaulyje sukelia infekcinės ligos, įskaitant virusus, bakterijas ir parazitus3,4.Infekciniai patogenai sutrikdo ląstelės šeimininkės genetinius mechanizmus, tokius kaip DNR atstatymas ir ląstelių ciklas, ir gali sukelti lėtinį uždegimą bei pažeisti imuninę sistemą5.
Su žmogaus vėžiu susiję infekciniai sukėlėjai yra labiausiai paplitę virusiniai patogenai, įskaitant žmogaus papilomos virusus ir hepatito B bei C virusus.Parazitai taip pat gali turėti įtakos žmogaus vėžio vystymuisi.Kelios parazitų rūšys, būtent Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis ir Hymenolepis nana, buvo susijusios su įvairių tipų žmogaus vėžiu 6,7,8.
Toxoplasma gondii yra tarpląstelinis pirmuonis, reguliuojantis užkrėstų šeimininkų ląstelių mikroaplinką.Apskaičiuota, kad šiuo parazitu užkrečiama maždaug 30 % pasaulio gyventojų, o tai kelia pavojų visai populiacijai9,10.Toxoplasma gondii gali užkrėsti gyvybiškai svarbius organus, įskaitant centrinę nervų sistemą (CNS), ir sukelti sunkias ligas, tokias kaip mirtinas meningitas ir encefalitas, ypač pacientams, kurių imunitetas nusilpęs9.Tačiau Toxoplasma gondii taip pat gali pakeisti užkrėsto šeimininko aplinką, moduliuodama imunokompetentingų asmenų ląstelių augimą ir imuninį atsaką, todėl išlieka besimptomė lėtinė infekcija9,11.Įdomu tai, kad atsižvelgiant į koreliaciją tarp T. gondii paplitimo ir smegenų navikų dažnio, kai kurie pranešimai rodo, kad in vivo šeimininko aplinkos pokyčiai dėl lėtinės T. gondii infekcijos yra panašūs į naviko mikroaplinką.
Egzosomos yra žinomos kaip tarpląsteliniai komunikatoriai, kurie tiekia biologinį turinį, įskaitant baltymus ir nukleino rūgštis, iš kaimyninių ląstelių16, 17.Egzosomos gali paveikti su naviku susijusius biologinius procesus, tokius kaip anti-apoptozė, angiogenezė ir metastazės naviko mikroaplinkoje.Visų pirma, miRNR (miRNR), mažos nekoduojančios RNR, kurių ilgis yra apie 22 nukleotidai, yra svarbūs potranskripcijos genų reguliatoriai, kurie kontroliuoja daugiau nei 30% žmogaus mRNR per miRNR sukeltą slopinimo kompleksą (miRISC).Toxoplasma gondii gali sutrikdyti biologinius procesus, kontroliuodamas miRNR ekspresiją užkrėstuose šeimininkuose.Šeimininko miRNR yra svarbių signalų, reguliuojančių šeimininko biologinius procesus, kad būtų pasiekta parazito išgyvenimo strategija.Taigi, tiriant šeimininko miRNR profilio pokyčius užsikrėtus T. gondii, galime aiškiau suprasti šeimininko ir T. gondii sąveiką.Iš tiesų, Thirugnanam ir kt.15 pasiūlė, kad T. gondii skatina smegenų kancerogenezę, pakeisdamas jo ekspresiją specifinėse šeimininko miRNR, susijusiose su naviko augimu, ir nustatė, kad T. gondii gali sukelti gliomas eksperimentiniams gyvūnams.
Šiame tyrime pagrindinis dėmesys skiriamas egzosominio miR-21 pokyčiams šeimininko mikroglijoje, užkrėstoje Toxoplasma BV2.Mes pastebėjome galimą pakitusio egzosominio miR-21 vaidmenį U87 gliomos ląstelių augime dėl FoxO1 / p27, kuris yra pernelyg išreikšto miR-21, branduolyje susilaikymo.
Iš BV2 gautos egzosomos buvo gautos naudojant diferencinį centrifugavimą ir patvirtintos įvairiais metodais, kad būtų išvengta užteršimo ląstelių komponentais ar kitomis pūslelėmis.SDS-poliakrilamido gelio elektroforezė (SDS-PAGE) parodė skirtingus baltymų, išskirtų iš BV2 ląstelių, ir egzosomų modelius (1A pav.), o mėginiuose buvo įvertintas Alix buvimas, kuris buvo ištirtas naudojant Western blot egzosominių baltymų žymenis .Alix žymėjimas buvo rastas egzosomų baltymuose, bet ne BV2 ląstelių lizato baltymuose (1B pav.).Be to, išgryninta RNR iš egzosomų, gautų iš BV2, buvo analizuojama naudojant bioanalizatorių.18S ir 28S ribosomų subvienetai retai buvo stebimi egzosominės RNR migracijos modelyje, o tai rodo patikimą grynumą (1C pav.).Galiausiai, transmisijos elektronų mikroskopija parodė, kad stebimos egzosomos buvo maždaug 60–150 nm dydžio ir turėjo egzosomų morfologijai būdingą taurės struktūrą (1D pav.).
Iš BV2 ląstelių gautų egzosomų apibūdinimas.(A) Saugos duomenų lapo puslapis.Baltymai buvo išskirti iš BV2 ląstelių arba egzosomų, gautų iš BV2.Ląstelių ir egzosomų baltymų modeliai skiriasi.(B) Eksosominio žymens (Alix) Western blot analizė.(C) Išgrynintos RNR iš BV2 ląstelių ir BV2 gautų egzosomų įvertinimas naudojant bioanalizatorių.Taigi, 18S ir 28S ribosomų subvienetai BV2 ląstelėse retai randami egzosominėje RNR.(D) Perdavimo elektronų mikroskopija parodė, kad iš BV2 ląstelių išskirtos egzosomos buvo neigiamai nudažytos 2% uranilo acetatu.Egzosomos yra maždaug 60–150 nm dydžio ir puodelio formos (Song ir Jung, neskelbti duomenys).
Iš BV2 gautų egzosomų ląstelių internalizavimas į U87 žmogaus gliomos ląsteles buvo stebimas naudojant konfokalinę mikroskopiją.PKH26 pažymėtos egzosomos yra lokalizuotos U87 ląstelių citoplazmoje.Branduoliai buvo nudažyti DAPI (2A pav.), o tai rodo, kad BV2 kilmės egzosomas gali internalizuoti ląstelės-šeimininkės ir paveikti recipiento ląstelių aplinką.
Iš BV2 gautų egzosomų internalizavimas į U87 gliomos ląsteles ir iš BV2 gautas egzosomas, užkrėstas Toxoplasma RH, sukėlė U87 gliomos ląstelių proliferaciją.(A) U87 ląstelių apimtos egzosomos, išmatuotos konfokaline mikroskopu.U87 gliomos ląstelės 24 valandas buvo inkubuojamos su egzosomomis, pažymėtomis PKH26 (raudona) arba be kontrolės.Branduoliai buvo nudažyti DAPI (mėlyna spalva) ir po to stebimi konfokaliniu mikroskopu (skalės juosta: 10 μm, x 3000).(B) U87 gliomos ląstelių proliferacija buvo nustatyta ląstelių proliferacijos tyrimu.U87 gliomos ląstelės nurodytą laiką buvo gydomos egzosomomis. *P < 0,05 gautas Stjudento t testu. *P < 0,05 gautas Stjudento t testu. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 pagal Stjudento t testą. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05, gautas naudojant Stjudento t testą.
Patvirtinus iš BV2 gautų egzosomų internalizavimą į U87 gliomos ląsteles, atlikome ląstelių proliferacijos tyrimus, kad ištirtume BV2 išvestų toksoplazmos kilmės egzosomų vaidmenį žmogaus gliomos ląstelių vystymuisi.U87 ląstelių apdorojimas T. gondii užkrėstų BV2 ląstelių egzosomomis parodė, kad T. gondii užkrėstos BV2 kilmės egzosomos sukėlė žymiai didesnį U87 ląstelių proliferaciją, palyginti su kontroline (2B pav.).
Be to, U118 ląstelių augimas turėjo tokius pačius rezultatus kaip ir U87, nes toksoplazmos stimuliuojamos egzosomos sukėlė didžiausią proliferacijos lygį (duomenys nerodomi).Remdamiesi šiais duomenimis, galime nurodyti, kad BV2 išvestos toksoplazmos užkrėstos egzosomos vaidina svarbų vaidmenį gliomos ląstelių proliferacijoje.
Norėdami ištirti toksoplazma užkrėstų BV2 egzosomų poveikį naviko vystymuisi, U87 gliomos ląsteles suleidome į nuogas peles ksenografo modeliui ir suleidome iš BV2 gautas egzosomas arba RH užkrėstas BV2 egzosomas.Po to, kai navikai išryškėjo po 1 savaitės, kiekviena eksperimentinė 5 pelių grupė buvo padalinta pagal naviko dydį, kad būtų nustatytas tas pats pradinis taškas, o naviko dydis buvo matuojamas 22 dienas.
Pelėms su U87 ksenografo modeliu 22 dieną buvo pastebėtas žymiai didesnis naviko dydis ir svoris BV2 kilmės RH infekuotų egzosomų grupėje (3A, B pav.).Kita vertus, po gydymo egzosomomis nebuvo reikšmingo naviko dydžio skirtumo tarp BV2 gautos egzosomų grupės ir kontrolinės grupės.Be to, pelėms, kurioms buvo sušvirkštos gliomos ląstelės ir egzosomos, buvo didžiausias naviko tūris RH infekuotų BV2 egzosomų grupėje (3C pav.).Šie rezultatai rodo, kad BV2 išvestos toksoplazmos užkrėstos egzosomos sukelia gliomos augimą pelės naviko modelyje.
Iš BV2 gautų egzosomų onkogenezė (AC) U87 ksenografinės pelės modelyje.Naviko dydis (A) ir svoris (B) žymiai padidėjo BALB/c nuogoms pelėms, gydomoms RH užkrėstomis egzosomomis, gautomis iš BV2.BALB/c nuogos pelės (C) buvo švirkščiamos po oda 1 x 107 U87 ląstelių, suspenduotų Matrigel mišinyje.Praėjus šešioms dienoms po injekcijos, pelėms buvo apdorota 100 μg BV2 gautų egzosomų.Naviko dydis ir svoris buvo matuojami atitinkamai nurodytomis dienomis ir po mirties. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05.
Duomenys parodė, kad 37 miRNR (16 per daug ekspresuotų ir 21 sumažėjusių), susijusių su imunitetu ar naviko vystymusi, buvo reikšmingai pakitusios mikroglijose po infekcijos Toxoplasma RH paderme (4A pav.).Santykiniai miR-21 ekspresijos lygiai tarp pakeistų miRNR buvo patvirtinti realaus laiko RT-PCR egzosomose, gautose iš BV2, egzosomose, apdorotose BV2 ir U87 ląstelėmis.MiR-21 ekspresija parodė reikšmingą egzosomų padidėjimą iš BV2 ląstelių, užkrėstų Toxoplasma gondii (RH štamu) (4B pav.).Santykiniai miR-21 ekspresijos lygiai BV2 ir U87 ląstelėse padidėjo po pakitusių egzosomų įsisavinimo (4B pav.).Santykinis miR-21 ekspresijos lygis augliu sergančių pacientų ir pelių, užsikrėtusių Toxoplasma gondii (ME49 padermė), smegenų audiniuose buvo atitinkamai didesnis nei kontrolinių (4C pav.).Šie rezultatai koreliuoja su skirtumais tarp prognozuojamų ir patvirtintų mikroRNR ekspresijos lygių in vitro ir in vivo.
Egzosominės miP-21a-5p ekspresijos pokyčiai mikroglijose, užkrėstose Toxoplasma gondii (RH).(A) rodo reikšmingus siRNR pokyčius, susijusius su imunitetu arba naviko vystymusi po T. gondii RH infekcijos.(B) Santykiniai miR-21 ekspresijos lygiai buvo nustatyti realaus laiko RT-PCR BV2 gautose egzosomose, BV2 apdorotose egzosomose ir U87 ląstelėse.(C) Santykiniai miR-21 ekspresijos lygiai buvo nustatyti naviku sergančių pacientų (N=3) ir pelių, užsikrėtusių Toxoplasma gondii (ME49 padermė) (N=3), smegenų audiniuose. *P < 0,05 gautas Stjudento t testu. *P < 0,05 gautas Stjudento t testu. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 buvo gautas naudojant Stjudento t testą. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05, gautas naudojant Stjudento t testą.
RH infekuotų BV2 ląstelių egzosomos paskatino gliomų augimą in vivo ir in vitro (2, 3 pav.).Norėdami aptikti atitinkamas mRNR, ištyrėme priešnavikinių tikslinių genų, šakės galvutės dėžutės O1 (FoxO1), PTEN ir užprogramuotos ląstelių mirties 4 (PDCD4) mRNR lygius U87 ląstelėse, užkrėstose egzosomomis, gautomis iš BV2 arba RH BV2.Bioinformatinė analizė parodė, kad keli su naviku susiję genai, įskaitant FoxO1, PTEN ir PDCD4 genus, turi miR-2121,22 surišimo vietas.Priešnavikinių tikslinių genų mRNR lygis buvo sumažintas RH užkrėstose BV2 egzosomose, palyginti su BV2 kilmės egzosomomis (5A pav.).FoxO1 parodė sumažėjusį baltymų kiekį RH užkrėstose BV2 kilmės egzosomose, palyginti su BV2 gautomis egzosomomis (5B pav.).Remdamiesi šiais rezultatais, galime patvirtinti, kad egzosomos, gautos iš RH užkrėsto BV2, sumažina anti-onkogeninių genų reguliavimą, išlaikydamos jų vaidmenį auglio augime.
Toxoplasma RH užkrėstos BV2 kilmės egzosomos sukelia priešnavikinių genų slopinimą U87 gliomos ląstelėse Toxoplasma RH užkrėstomis BV2 egzosomomis.(A) FoxO1, PTEN ir PDCD4 ekspresijos realaus laiko PGR egzosomose, gautose iš T. gondii RH užkrėsto BV2, palyginti su PBS egzosomomis.β-aktino mRNR buvo naudojama kaip kontrolė.(B) FoxO1 ekspresija buvo nustatyta Western blot metodu, o densitometrijos duomenys buvo statistiškai įvertinti naudojant ImageJ programą. *P < 0,05 gautas Stjudento t testu. *P < 0,05 gautas Stjudento t testu. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 buvo gautas naudojant Stjudento t testą. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05, gautas naudojant Stjudento t testą.
Norint suprasti miP-21 poveikį egzosomose su naviku susijusiam genų reguliavimui, U87 ląstelės buvo transfekuotos miP-21 inhibitoriumi, naudojant Lipofectamine 2000, ir ląstelės buvo surinktos praėjus 24 valandoms po transfekcijos.FoxO1 ir p27 ekspresijos lygiai ląstelėse, transfekuotose miR-21 inhibitoriais, buvo lyginami su ląstelėmis, apdorotomis iš BV2 gautomis egzosomomis, naudojant qRT-PGR (6A, B pav.).MiR-21 inhibitoriaus transfekcija į U87 ląsteles žymiai sumažino FoxO1 ir p27 ekspresiją (6 pav.).
RH užkrėstas egzosominis BV2 gautas miP-21 pakeitė FoxO1 / p27 ekspresiją U87 gliomos ląstelėse.U87 ląstelės buvo transfekuotos miP-21 inhibitoriumi, naudojant Lipofectamine 2000, ir ląstelės buvo surinktos praėjus 24 valandoms po transfekcijos.FoxO1 ir p27 ekspresijos lygiai ląstelėse, transfekuotose miR-21 inhibitoriais, buvo lyginami su lygiais ląstelėse, apdorotose BV2 gautomis egzosomomis, naudojant qRT-PCR (A, B).
Kad išvengtų šeimininko imuninio atsako, toksoplazmos parazitas virsta audinių cista.Jie parazituoja įvairiuose audiniuose, įskaitant smegenis, širdį ir skeleto raumenis, per visą šeimininko gyvenimą ir moduliuoja šeimininko imuninį atsaką.Be to, jie gali reguliuoti ląstelių ciklą ir šeimininkų ląstelių apoptozę, skatindami jų dauginimąsi14,24.Toxoplasma gondii daugiausia užkrečia šeimininko dendritines ląsteles, neutrofilus ir monocitų / makrofagų liniją, įskaitant smegenų mikroglijas.Toxoplasma gondii sukelia M2 fenotipo makrofagų diferenciaciją, turi įtakos žaizdų gijimui po patogeninės infekcijos, taip pat yra susijusi su hipervaskuliarizacija ir granulomatine fibroze.Ši toksoplazmos infekcijos elgesio patogenezė gali būti susijusi su žymenimis, susijusiais su naviko vystymusi.Toxoplasma reguliuojama priešiška aplinka gali būti panaši į atitinkamą ikivėžį.Todėl galima daryti prielaidą, kad toksoplazmos infekcija turėtų prisidėti prie smegenų auglių vystymosi.Tiesą sakant, buvo pranešta apie didelį toksoplazmos infekcijos dažnį pacientų, sergančių įvairiais smegenų augliais, serume.Be to, Toxoplasma gondii gali būti dar vienas kancerogeninis efektorius ir veikti sinergiškai, kad padėtų kitiems infekciniams kancerogenams vystytis smegenų augliams.Šiuo atžvilgiu verta paminėti, kad P. falciparum ir Epstein-Barr virusas sinergiškai prisideda prie Burkitt limfomos susidarymo.
Egzosomų, kaip reguliatorių, vaidmuo vėžio tyrimų srityje buvo plačiai ištirtas.Tačiau egzosomų vaidmuo tarp parazitų ir užkrėstų šeimininkų tebėra menkai suprantamas.Iki šiol įvairūs reguliatoriai, įskaitant išskiriamus baltymus, paaiškino biologinius procesus, kuriais pirmuonių parazitai priešinasi šeimininko atakai ir išlaiko infekciją.Pastaruoju metu populiarėja koncepcija, kad su pirmuoniais susijusios mikropūslelės ir jų mikroRNR sąveikauja su šeimininko ląstelėmis, kad sukurtų palankią aplinką jų išgyvenimui.Todėl reikia atlikti tolesnius tyrimus, siekiant išsiaiškinti ryšį tarp pakitusių egzosominių miRNR ir gliomos ląstelių proliferacijos.MikroRNR pakeitimas (klasterių genai miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 ir miR-17-92) jungiasi su STAT3 promotoriumi toksoplazma užkrėstuose žmogaus makrofaguose, yra reguliuojamas ir sukelia anti - apoptozė, reaguojant į Toxoplasma gondii infekciją 29 .Toksoplazmos infekcija padidina miR-17-5p ir miR-106b-5p ekspresiją, kurios yra susijusios su keliomis hiperproliferacinėmis ligomis 30 .Šie duomenys rodo, kad toksoplazmos infekcijos reguliuojamos šeimininko miRNR yra svarbios parazitų išgyvenimo ir patogenezės molekulės šeimininko biologiniame elgesyje.
Pakitusios miRNR gali turėti įtakos įvairių tipų elgesiui piktybinių ląstelių, įskaitant gliomas, atsiradimo ir progresavimo metu: augimo signalų savarankiškumas, nejautrumas augimą slopinantiems signalams, apoptozės vengimas, neribotas replikacijos potencialas, angiogenezė, invazija ir metastazės bei uždegimas.Gliomos atveju pakitusios miRNR buvo nustatytos keliuose ekspresijos profiliavimo tyrimuose.
Šiame tyrime patvirtinome aukštą miRNR-21 ekspresijos lygį toksoplazma užkrėstose šeimininko ląstelėse.Buvo nustatyta, kad miR-21 yra viena iš dažniausiai per daug ekspresuojamų mikroRNR kietuosiuose navikuose, įskaitant gliomas, 33 ir jo ekspresija koreliuoja su gliomos laipsniu.Kaupiami įrodymai rodo, kad miR-21 yra naujas onkogenas, kuris veikia kaip anti-apoptotinis gliomos augimo faktorius ir yra labai per daug ekspresuojamas žmogaus smegenų piktybinių navikų audiniuose ir plazmoje.Įdomu tai, kad miR-21 inaktyvacija gliomos ląstelėse ir audiniuose sukelia ląstelių proliferacijos slopinimą dėl nuo kaspazės priklausomos apoptozės.Bioinformatinė miR-21 numatytų taikinių analizė atskleidė daugybę naviko slopinimo genų, susijusių su apoptozės keliais, įskaitant užprogramuotą ląstelių mirtį 4 (PDCD4), tropomioziną (TPM1), PTEN ir šakės galvutės dėžutę O1 (FoxO1), su miR-2121 surišimo vieta..22.38.
FoxO1, kaip vienas iš transkripcijos faktorių (FoxO), dalyvauja vystant įvairių tipų žmogaus vėžį ir gali reguliuoti naviko slopinimo genų, tokių kaip p21, p27, Bim ir FasL40, ekspresiją.FoxO1 gali surišti ir aktyvuoti ląstelių ciklo inhibitorius, tokius kaip p27, kad slopintų ląstelių augimą.Be to, FoxO1 yra pagrindinis PI3K / Akt signalizacijos efektorius ir reguliuoja daugelį biologinių procesų, tokių kaip ląstelių ciklo progresavimas ir ląstelių diferenciacija aktyvinant p2742 transkripciją.
Apibendrinant, manome, kad egzosominis miR-21, gautas iš toksoplazma užkrėstų mikroglijų, gali atlikti svarbų vaidmenį kaip gliomos ląstelių augimo reguliatorius (7 pav.).Tačiau reikia atlikti tolesnius tyrimus, kad būtų galima rasti tiesioginį ryšį tarp egzosominio miR-21, pakitusios Toxoplasma infekcijos ir gliomos augimo.Tikimasi, kad šie rezultatai taps atskaitos tašku tiriant ryšį tarp toksoplazmos infekcijos ir gliomos paplitimo.
Šiame tyrime siūloma gliomos (smegenų) kancerogenezės mechanizmo schema.Autorius piešia „PowerPoint 2019“ („Microsoft“, Redmond, WA).
Visi šio tyrimo eksperimentiniai protokolai, įskaitant gyvūnų naudojimą, atitiko Seulo nacionalinio universiteto gyvūnų priežiūros ir naudotojų komiteto standartines etikos gaires ir buvo patvirtinti Seulo nacionalinės universiteto medicinos mokyklos institucinės peržiūros tarybos (IRB numeris SNU- 150715).-2).Visos eksperimentinės procedūros buvo atliktos pagal ARRIVE rekomendacijas.
BV2 pelės mikroglijos ir U87 žmogaus gliomos ląstelės buvo kultivuojamos atitinkamai Dulbecco modifikuotoje erelio terpėje (DMEM; Welgene, Seulas, Korėja) ir Roswell Park Memorial Institute terpėje (RPMI; Welgene), kurių kiekvienoje buvo 10% galvijų vaisiaus serumo, 4 mM l- glutamino, 0,2 mM penicilino ir 0,05 mM streptomicino.Ląstelės buvo auginamos inkubatoriuje su 5% CO2 37 ° C temperatūroje.Kita gliomos ląstelių linija, U118, buvo naudojama palyginimui su U87 ląstelėmis.
Norint išskirti egzosomas iš T. gondii užkrėstų RH ir ME49 padermių, T. gondii tachizoitai (RH padermė) buvo paimti iš 6 savaičių amžiaus BALB/c pelių, kurioms buvo sušvirkšta prieš 3-4 dienas, pilvo ertmės.Tachizoitai buvo tris kartus plaunami PBS ir išgryninti centrifuguojant 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV)43.Norint gauti ME49 padermės tachizoitus, BALB/c pelėms buvo intraperitoniniu būdu sušvirkšta 20 audinių cistų, o tachizoito transformacija cistose buvo surinkta plaunant pilvo ertmę 6–8 dieną po užsikrėtimo (PI).Pelės, užkrėstos PBS.ME49 tachizoitai buvo auginami ląstelėse, papildytose 100 μg/ml penicilino (Gibco/BRL, Grand Island, NY, JAV), 100 μg/ml streptomicino (Gibco/BRL) ir 5% galvijų vaisiaus serumo (Lonza, Walkersville, MD). .., JAV) 37 °C temperatūroje ir 5 % anglies dioksido.Po kultivavimo Vero ląstelėse ME49 tachizoitai buvo du kartus perleisti per 25 dydžio adatą, o po to per 5 µm filtrą, kad būtų pašalintos šiukšlės ir ląstelės.Po plovimo tachizoitai buvo pakartotinai suspenduoti PBS44.Toxoplasma gondii padermės ME49 audinių cistos buvo palaikomos į pilvaplėvės ertmę suleidžiant cistas, išskirtas iš užkrėstų C57BL/6 pelių smegenų (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korėja).ME49 užkrėstų pelių smegenys buvo paimtos po 3 mėnesių PI ir susmulkintos po mikroskopu, kad būtų atskirtos cistos.Užkrėstos pelės buvo laikomos specialiomis sąlygomis be patogenų (SPF) Seulo nacionalinio universiteto medicinos mokykloje.
Bendra RNR buvo išgauta iš BV2 gautų egzosomų, BV2 ląstelių ir audinių naudojant miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Vokietija) pagal gamintojo instrukcijas, įskaitant eliuavimo etapo inkubacijos laiką.RNR koncentracija buvo nustatyta NanoDrop 2000 spektrofotometru.RNR mikrogardelių kokybė buvo įvertinta naudojant Agilent 2100 bioanalizatorių (Agilent Technologies, Amstelveen, Nyderlandai).
DMEM su 10% egzosomų silpnu FBS buvo paruoštas ultracentrifuguojant 100 000 g 16 valandų 4 ° C temperatūroje ir filtruojamas per 0, 22 µm filtrą (Nalgene, Rochester, NY, JAV).BV2 ląstelės, 5 × 105, buvo kultivuojamos DMEM, kuriame yra 10% egzosomų išeikvoto FBS ir 1% antibiotikų 37 ° C temperatūroje ir 5% CO2.Po 24 valandų inkubacijos į ląsteles buvo pridėta RH arba ME49 padermės tachizoitai (MOI = 10), o neinvazuojantys parazitai buvo pašalinti per valandą ir pakartotinai užpildyti DMEM.BV2 ląstelių egzosomos buvo išskirtos modifikuotu diferenciniu centrifugavimu, plačiausiai naudojamu metodu.Iš naujo suspenduokite egzosomos nuosėdas 300 µl PBS RNR arba baltymų analizei.Išskirtų egzosomų koncentracija buvo nustatyta naudojant BCA baltymų tyrimo rinkinį (Pierce, Rockford, IL, JAV) ir NanoDrop 2000 spektrofotometrą.
Nuosėdos iš BV2 ląstelių arba egzosomos, gautos iš BV2, buvo lizuojamos PRO-PREP ™ baltymų ekstrahavimo tirpale (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korėja), o baltymai buvo įkelti į Coomassie briliantiškai mėlynai dažytus 10% SDS poliakrilamido gelius.Be to, baltymai buvo perkelti į PVDF membranas 2 valandas.Western blotai buvo patvirtinti naudojant Alix antikūną (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, JAV) kaip egzosominį žymeklį.Kaip antrinis antikūnas buvo naudojamas HRP konjuguotas ožkos anti-pelės IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, JAV) ir LAS-1000 plius liuminescencinis vaizdo analizatorius (Fuji Photography Film, Tokijas, Japonija)..Egzosomų dydžiui ir morfologijai ištirti buvo atlikta transmisijos elektronų mikroskopija.Iš BV2 ląstelių išskirtos egzosomos (6,40 µg/µl) buvo paruoštos ant anglimi dengtų tinklelių ir neigiamai nudažytos 2% uranilo acetatu 1 min.Paruošti mėginiai buvo stebimi esant 80 kV greitinimui, naudojant JEOL 1200-EX II (Tokijas, Japonija) su ES1000W Erlangshen CCD kamera (Gatanas, Pleasantonas, CA, JAV).
Iš BV2 gautos egzosomos buvo nudažytos naudojant PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV) 15 minučių kambario temperatūroje.U87 ląstelės, 2 × 105, su PKH26 pažymėtomis egzosomomis (raudona) arba be egzosomų kaip neigiama kontrolė, buvo inkubuojamos 37 ° C temperatūroje 24 valandas 5% CO2 inkubatoriuje.U87 ląstelių branduoliai buvo nudažyti DAPI (mėlyna), U87 ląstelės buvo fiksuotos 4% paraformaldehidu 15 minučių 4 ° C temperatūroje ir tada analizuojamos Leica TCS SP8 STED CW konfokalinio mikroskopo sistemoje (Leica Microsystems, Manheimas, Vokietija).stebimas.
cDNR buvo susintetinta iš siRNR, naudojant Mir-X siRNA pirmosios grandinės sintezę ir SYBR qRT-PCR rinkinį (Takara Bio Inc., Shiga, Japonija).Realaus laiko kiekybinė PGR buvo atlikta naudojant iQ5 realaus laiko PGR aptikimo sistemą (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV), naudojant pradmenis ir šablonus, sumaišytus su SYBR Premix.DNR buvo amplifikuota 40 denatūravimo ciklų 95 ° C temperatūroje 15 s ir atkaitinimo 60 ° C temperatūroje 60 s.Kiekvienos PGR reakcijos duomenys buvo analizuojami naudojant iQ™5 optinės sistemos programinės įrangos (Bio-Rad) duomenų analizės modulį.Santykiniai genų ekspresijos pokyčiai tarp pasirinktų tikslinių genų ir β-aktino/siRNR (ir U6) buvo apskaičiuoti naudojant standartinės kreivės metodą.Naudotos pradmenų sekos parodytos 1 lentelėje.
3 x 104 U87 gliomos ląstelės buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokšteles ir sumaišytos su toksoplazma užkrėstomis egzosomomis, gautomis iš BV2 (50 μg/mL) arba nepulsinėmis egzosomomis, gautomis iš BV2 (50 μg/mL), kaip kontrolinės medžiagos 12, 18 ir 36 val. .Ląstelių proliferacijos greitis buvo nustatytas naudojant ląstelių skaičiavimo rinkinį-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonija) (papildomi S1-S3 paveikslai) 46 .
5 savaičių amžiaus BALB / c nuogos pelių patelės buvo įsigytos iš Orient Bio (Seongnam-si, Pietų Korėja) ir laikomos atskirai steriliuose narvuose kambario temperatūroje (22 ± 2 ° C) ir drėgmei (45 ± 15 ° C).%) kambario temperatūroje (22±2°C) ir drėgmei (45±15%).12 valandų šviesos ciklas ir 12 valandų tamsos ciklas buvo atlikti naudojant SPF (Seulo nacionalinės universiteto medicinos mokyklos gyvūnų centras).Pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į tris grupes po 5 peles ir visoms grupėms po oda buvo sušvirkšta 400 ml PBS, kuriame yra 1 x 107 U87 gliomos ląstelės ir sumažintas augimo faktorius BD Matrigel™ (BD Science, Majamis, FL, JAV).Praėjus šešioms dienoms po naviko injekcijos, į naviko vietą buvo sušvirkšta 200 mg egzosomų, gautų iš BV2 ląstelių (su toksoplazmos infekcija arba be jos).Praėjus dvidešimt dviem dienoms po naviko užsikrėtimo, kiekvienos grupės pelių naviko dydis buvo matuojamas slankmačiu tris kartus per savaitę, o naviko tūris buvo apskaičiuotas pagal formulę: 0,5 × (plotis) × 2 × ilgis.
MikroRNR ekspresijos analizė naudojant miRCURYTM LNA miRNR masyvą, 7-oji karta turi, mmu ir rno matricas (EXIQON, Vedbaek, Danija), apimančias 1119 gerai apibūdintų pelių tarp 3100 žmogaus, pelių ir žiurkių miRNR gaudymo zondų.Šios procedūros metu nuo 250 iki 1000 ng bendros RNR buvo pašalinta iš 5'-fosfato, apdorojant veršelio žarnyno šarmine fosfataze, po to ženklinant Hy3 žaliais fluorescenciniais dažais.Tada pažymėti mėginiai buvo hibridizuoti įkeliant mikrogardelių stiklelius, naudojant hibridizacijos kameros rinkinį (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, JAV) ir hibridizacijos stiklelių rinkinį (Agilent Technologies).Hibridizacija buvo vykdoma 16 valandų 56°C temperatūroje, po to mikrogardelės buvo plaunamos pagal gamintojo rekomendacijas.Tada apdorotos mikrogardelių skaidrės buvo nuskaitytos naudojant „Agilent G2565CA microarray“ skaitytuvo sistemą („Agilent Technologies“).Nuskaityti vaizdai buvo importuoti naudojant „Agilent Feature Extraction“ programinės įrangos versiją 10.7.3.1 („Agilent Technologies“), o kiekvieno vaizdo fluorescencijos intensyvumas buvo kiekybiškai įvertintas naudojant atitinkamą modifikuoto „Exiqon“ protokolo GAL failą.Dabartinio tyrimo „Microarray“ duomenys yra saugomi GEO duomenų bazėje su registracijos numeriu GPL32397.
Subrendusių egzosominių miRNR ekspresijos profiliai RH arba ME49 padermių, užkrėstų Toxoplasma, mikroglijose, buvo analizuojami naudojant įvairius tinklo įrankius.miRNR, susijusios su naviko vystymusi, buvo identifikuotos naudojant miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) ir išfiltruotos, kai normalizuotas signalo intensyvumas (log2) didesnis nei 8,0.Tarp miRNR buvo nustatyta, kad skirtingai išreikštos miRNR pakitusios daugiau nei 1,5 karto, atlikus miRNR, pakeistų RH arba ME49 padermių, užkrėstų T. gondii, filtravimo analizę.
Ląstelės buvo pasėtos į šešių šulinėlių plokšteles (3 x 105 ląstelės / duobutėje) opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, JAV), naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV).Transfekuotos ląstelės buvo kultivuojamos 6 valandas, o po to terpė buvo pakeista į šviežią pilną terpę.Ląstelės buvo surinktos praėjus 24 valandoms po transfekcijos.
Statistinė analizė daugiausia buvo atlikta naudojant Studento t-testą su Excel programine įranga (Microsoft, Vašingtonas, DC, JAV).Eksperimentinei gyvūnų analizei buvo atlikta dvipusė ANOVA naudojant Prism 3.0 programinę įrangą (GraphPad Software, La Jolla, CA, JAV). P vertės < 0,05 buvo laikomos statistiškai reikšmingomis. P vertės < 0,05 buvo laikomos statistiškai reikšmingomis. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P reikšmės <0,05 buvo laikomos statistiškai reikšmingomis. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义. P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P reikšmės <0,05 buvo laikomos statistiškai reikšmingomis.
Visus šiame tyrime naudotus eksperimentinius protokolus patvirtino Seulo nacionalinės universiteto medicinos mokyklos institucinė peržiūros taryba (IRB numeris SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. ir kt.Įvertintas pasaulinis sergamumas vėžiu ir mirtingumas nuo 2018 m.: GLOBOCAN šaltiniai ir metodai.Interpretacija.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Įžvalga apie smegenų auglių rizikos veiksnius ir jų terapines intervencijas. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Įžvalga apie smegenų auglių rizikos veiksnius ir jų terapines intervencijas.Rashid, S., Rehman, K. ir Akash, MS Smegenų navikų rizikos veiksnių ir pagrindinių terapinių intervencijų apžvalga. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施. Rasheed, S., Rehman, K. ir Akash, MS Gilus smegenų auglio rizikos veiksnių ir terapinių intervencijų supratimas.Rashid, S., Rehman, K. ir Akash, MS Smegenų navikų rizikos veiksnių ir pagrindinių terapinių intervencijų apžvalga.Biomedicinos mokslas.Vaistininkas.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterijų ir virusų sąveika sergant žmogaus virškinimo trakto ir moterų lytinių organų vėžiu: epidemiologinių ir laboratorinių įrodymų santrauka. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterijų ir virusų sąveika sergant žmogaus virškinimo trakto ir moterų lytinių organų vėžiu: epidemiologinių ir laboratorinių įrodymų santrauka.Kato I., Zhang J. ir Sun J. Bakterijų ir virusų sąveika sergant žmogaus virškinamojo trakto ir moterų lytinių organų vėžiu: epidemiologinių ir laboratorinių duomenų santrauka. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J.据总结. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterijų ir virusų sąveika žmogaus burnos ertmės virškinime ir moterų reprodukciniame trakte: populiarių ligų mokslo ir laboratorinių įrodymų santrauka.Kato I., Zhang J. ir Sun J. Bakterijų ir virusų sąveika sergant žmogaus virškinimo trakto vėžiu ir moterų lytinių organų vėžiu: epidemiologinių ir laboratorinių duomenų santrauka.Vėžys 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Nuo infekcijos iki vėžio: kaip DNR naviko virusai keičia šeimininko ląstelės centrinę anglies ir lipidų apykaitą. Magon, KL & Parish, JL Nuo infekcijos iki vėžio: kaip DNR naviko virusai keičia šeimininko ląstelės centrinę anglies ir lipidų apykaitą.Mahonas, KL ir Parish, JL Ugnies infekcija į vėžį: kaip DNR pagrįsti naviko virusai keičia šeimininko ląstelių centrinę anglies ir lipidų apykaitą. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质仂 Magon, KL & Parish, JL Nuo infekcijos iki vėžio: kaip DNR naviko virusai keičia šeimininko ląstelės centrinę anglies ir lipidų apykaitą.Mahonas, KL ir Parish, JL Užsikrėsta vėžiu: kaip DNR naviko virusai keičia centrinę anglies ir lipidų apykaitą šeimininkų ląstelėse.Atviroji biologija.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM ir kt.Katecholiniai estrogenai iš schistosomų ir kepenų sruogų bei su helmintu susijusio vėžio.priekyje.karšta viduje.5, 444 (2014).